《酶免疫分析技术》ppt课件

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1、第七章酶免疫分析技术目　录概述1酶联免疫吸附试验2酶联免疫吸附试验的应用和注意事项3其他酶标记免疫测定技术4返回总目录酶免疫分析技术的分类克隆酶供体免疫测定酶免疫分析技术酶免疫组织化学技术酶免疫测定技术均相酶免疫测定非均相酶免疫测定酶放大免疫测定技术液相酶免疫测定固相酶免疫测定3第一节概述一、基本原理酶免疫分析技术的原理是利用酶标记抗体(抗原)形成酶标抗体(抗原)结合物，此结合物既保留抗体(抗原)的免疫活性，又保留了酶对底物的催化活性。酶标抗体(抗原)与相应抗原(抗体)进行反应后，酶催化相应的底物显色，借助酶作用于底物的显色反应来判定结果。二、酶和酶底

2、物标记酶的要求：①活性高，纯度高②作用专一性强③性质稳定，易与抗原或抗体偶联④测定方法简便易行、敏感、精确⑤酶和底物对人体无害⑥酶和底物价廉易得（一）辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase,HRP）2.糖蛋白（主酶）亚铁血红素（辅基）主酶与酶活性无关辅基是酶的活性中心3.RZ值：403nm(辅基)与275nm(主酶)OD值之比4.RZ值与酶活性无关，酶活性单位比RZ值更为重要1.ELISA中应用最为广泛的标记用酶DH2十H2O2—D十2H20HRP催化的反应式为：DH2为供氢体，习惯称为底物，H2O2为受氢体HRP对受氢体的专一性很

3、高，作用底物有多种。邻苯二胺OPD四甲基联苯胺TMB5-氨基水杨酸5-ASA2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐ABTSHRP常用底物OPD反应后显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄色，测定波长492nm。不稳定，有致癌性。TMB反应后显蓝色，加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm，稳定，无致癌性，ELISA中应用最广泛的底物。（二）碱性磷酸酶（alkalinephosphatase，AP)是一种磷酸酯水解酶，从大肠杆菌提取AP的底物对-硝基苯磷酸酯（pNPP）经AP作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405nm。（三）β-半乳

4、糖苷酶（β-galactosidase，β-Gal）源于大肠埃希菌，常用于均相酶免疫测定。β-Gal的底物4-甲基伞酮基β-D半-乳糖苷（4MUG）酶作用后，生成高强度荧光物，用荧光计测量。（四）其他酶在商品试剂中，经常应用的酶还有葡萄糖氧化酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、溶菌酶、青霉素酶、脲酶、苹果酸脱氢酶等。三、酶标抗体(抗原)的制备制备要求：抗原要求纯度高、抗原性强。抗体则要求特异性强、效价高、亲和力强、易于分离纯化和批量生产。（一）常用的标记方法标记方法要求：①方法简单，产率高②不影响酶和抗体(抗原)的生物活性③所得酶结合物稳定，本身不发生聚合④较少

5、形成酶与酶、抗体与抗体或抗原与抗原的聚合物1．过碘酸钠氧化法仅用于HRP的标记。可与抗体蛋白的游离氨基结合，形成HRP-CH2-NH-IgG。此法酶标记物产率较高，但纯化后仍有少量游离IgG，部分结合物可能聚合，抗体的活性可能有所降低。2．戊二醛交联法戊二醛分子中有两个相同的醛基，可分别与酶和抗体（抗原）分子上的氨基结合。该法有一步法和二步法。二步法标记效率比一步法高，酶标记物质量较均一。（二）酶标记物的纯化与鉴定1．酶标记物的纯化标记完成后应除去反应溶液中的游离酶、游离抗体(抗原)、酶聚合物及抗体(抗原)聚合物，避免游离酶增加非特异显色以及游离抗体(

6、抗原)的竞争作用。常用的纯化方法有葡聚糖凝胶层析法和饱和硫酸铵沉淀法等。2.酶标记物的鉴定（1）免疫活性鉴定：常用免疫电泳或双向免疫扩散法，出现沉淀线表示结合物中的抗体(抗原)具有免疫活性。（2）酶标记率测定：用分光光度法分别测定结合物中酶和抗体(抗原)蛋白的含量，然后按公式计算其标记率。四、固相载体（一）固相载体的要求①结合抗体(抗原)的容量大，结合稳定；②可结合抗原或抗体及亲和素或链霉亲和素等大分子；③固相化后分子仍应保持活性；④固相化方法应简便、快速。（二）固相载体的种类1．塑料制品由聚苯乙烯、聚氯乙烯制成。形状主要有微量反应板、小试管和小珠三种

7、。2．微颗粒微颗粒是由高分子单体聚合成的微球或颗粒。3.微孔虑膜是一种多孔薄膜过滤材料，包括硝酸纤维素膜（NC）、尼龙膜和玻璃纤维素膜等。微量反应板返回章目录第二节酶联免疫吸附试验一、基本原理将已知抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤的方法将固相上的抗原抗体复合物与液相中的游离成分分开。加入酶的底物后，通过酶对底物催化的显色反应程度，对标本中抗原或抗体进行定性或定量。二、酶联免疫吸附试验的类型（一）双抗体夹心法检测抗原将己知抗体包被固相载体，待检标本中的相应抗原与固相表面的抗体结合，洗涤去除未结合成分。然后再与抗原特异的酶

8、标抗体结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体复合物，根据加底物后的显色程度确定待检抗原的含量。1.