《酶免疫技术》课件

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1、第八章酶免疫技术教学目的要求：1.掌握酶和酶作用的底物、酶标记的抗体或抗原；熟练掌握固相载体。2.熟练掌握酶免疫技术的分类3.熟练掌握酶联免疫吸附试验的方法类型及原理4.掌握酶免疫测定的应用放射免疫技术荧光免疫技术酶免疫技术三大经典标记技术三大经典标记技术基本原理抗原抗体反应的特异性+酶高效催化反应的专一性酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应酶对底物的显色反应对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析第一节酶免疫技术的特点基本原理酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应酶对底物的显色反应对抗原或

2、抗体进行定位、定性或定量的测定分析第一节酶免疫技术的特点底物E酶标抗体EE抗原一、酶和酶作用底物（一）标记酶的要求：①活性高，纯度高②作用专一性强③性质稳定，易与抗原或抗体偶联④测定方法简便易行、敏感、精确⑤酶和底物对人体无害⑥酶和底物价廉易得辣根过氧化物酶（HRP）糖蛋白（主酶）亚铁血红素（辅基）主酶与酶活性无关辅基是酶的活性中心RZ值：403nm（辅基）　　　与275nm（主酶）OD值之比纯度数（RZ）值与酶活性无关，酶活性单位（U）比RZ值更为重要酶的纯度并不代表酶的活力国内以辣根过氧化酶最为常用

3、1、辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase,HRP）（一）常用的酶DH2+H2O2→→→D+2H2O供氢体DH2习惯上被称为底物，底物有多种H2O2为受氢体，HRP对受氢体的专一性很高HRP催化的反应式为：HRP邻苯二胺OPD反应后显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄色，测定波长492nm。不稳定，有致癌性。四甲基联苯胺TMB反应后显蓝色，加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm，稳定，无致癌性，ELISA中应用最广泛的底物。HRP常用底物（二）碱性磷酸酶（alkalinephospha

4、tase，AP)是一种磷酸酯水解酶，从大肠杆菌提取AP的底物对-硝基苯磷酸酯（pNPP）经AP作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405nm。敏感性高于HRP,但不易获得高纯度的制品、稳定性差，价格贵（三）β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，β-Gal）源于大肠埃希菌，常用于均相酶免疫测定。β-Gal的底物4-甲基伞酮基-β-D半乳糖苷（4MUG）酶作用后，生成高强度荧光物，用荧光计测量。二、酶标记抗体或抗原酶免疫技术的核心组成部分酶结合物酶标记物通过化学反应或免疫学反应，让酶与抗体

5、或抗原形成的结合物（一）酶标记抗体或抗原的制备标记方法要求技术方法简单、产率高，重复性好标记反应不影响酶和抗原或抗体的活性酶标记物稳定，不易发生解离制备方法2.过碘酸钠氧化法常用于HRP标记抗体或抗原1.戊二醛交联法适合各种酶蛋白的标记。（二）酶标记物的纯化与鉴定1．酶标记物的纯化标记完成后应除去反应溶液中的游离酶、游离抗体(抗原)、酶聚合物及抗体(抗原)聚合物，避免游离酶增加非特异显色以及游离抗体(抗原)的竞争作用。常用的纯化方法有葡聚糖凝胶层析法和饱和硫酸铵沉淀法等。2.酶标记物的鉴定（1）免疫活性

6、鉴定：常用免疫电泳或双向免疫扩散法，出现沉淀线表示结合物中的抗体(抗原)具有免疫活性。（2）酶标记率测定：用分光光度法分别测定结合物中酶和抗体(抗原)蛋白的含量，然后按公式计算其标记率。三、固相载体固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将游离和结合的酶标记物迅速分离的最常用方法固相抗体或抗原:就是把抗体或抗原结合到固相载体的表面（一）固相载体的要求结合抗体或抗原的容量大抗体或抗原牢固地固定在其表面不影响免疫反应性利于反应充分进行固相方法简便易行，快速经济（二）固相载体的种类1．塑料制品由聚苯乙烯、聚氯乙烯制成

7、。形状。主要有微量反应板、小试管和小珠三种。2．微颗粒微颗粒是由高分子单体聚合成的微球或颗粒。3.微孔虑膜是一种多孔薄膜过滤材料，包括硝酸纤维素膜（NC）、尼龙膜和玻璃纤维素膜等。微量反应板（三）包被与封闭将抗原或抗体固相化结合在固相载体上的过程称为包被（coating)。以聚笨乙烯固相载体（如制ELISA板）为例说明免疫吸附的过程：抗原（抗体）→用PH9.6的碳酸盐溶液稀释　→4ºC过夜　→　用10%的小牛血清再包被一次，以消除固相载体表面未吸附的位点，此过程叫做封闭。第二节酶免疫技术的分类克隆酶供体

8、免疫测定酶免疫分析技术酶免疫组织化学技术酶免疫测定技术均相酶免疫测定异相酶免疫测定酶放大免疫测定技术液相酶免疫测定固相酶免疫测定：酶联免疫吸附试验(ELISA)组织切片或其它标本中抗原的定位分析液体标本中抗原或抗体的定性和定量24一、均相酶免疫测定法酶蛋白与抗原或抗体结合形成酶标记物。未与抗原（抗体）结合的标记抗体（抗原），称为游离标记物。与抗原（抗体）结合的标记抗体（抗原），称为结合标记物。Ag+Ab-EAgAb-E+Ab-E（以标记Ab