《酶免疫技术》PPT课件(I)

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1、《免疫学检验》吴倩讲师卫生检验系公共卫生学院南京医科大学025-8686293813921433351wuqian@njmu.edu.cn第一节　酶免疫技术的原理第二节酶免疫技术的分类第三节酶联免疫吸附试验第四节固相酶免疫测定的技术要点第五节酶免疫组织化学技术第六节其他酶免疫技术第七节酶免疫测定的应用第八章酶免疫技术第一节酶免疫技术的原理主要试剂:酶标记的抗体或抗原酶标物特点：免疫学活性酶对底物的催化活性抗原抗体反应的特异性+酶促催化反应的高敏感性原理及特点特点：灵敏度高、特异性强、准确性好酶标记试剂能够较长时间保持稳

2、定操作简便、对环境没有污染。易与其它技术偶联衍生出适用范围更广的新方法。原理：酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应酶对底物的显色反应对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析原理及特点第二节　酶免疫技术分类酶免疫技术酶免疫组化酶免疫测定均相异相固相酶免疫测定液相酶免疫测定组织切片中的抗原抗体反应液体标本中抗原或抗体的定性和定量(ELISA)用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定酶标记物与相应的抗原或抗体结合后，标记酶的活性会发生改变，不用分离结合和游离酶标记物，通过测定标记酶的活性的改变，而确定抗原或抗体的含量。

3、Ag+Ab-EAg-Ab-E+?原理一、均相酶免疫测定最具代表性的两种技术酶放大免疫测定技术EMITenzyme-mutipliedimmunoassaytechnique克隆酶供体免疫分析CEDIAclonedenzymedonorimmunoassay均相酶免疫测定EMIT示意图CEDIA示意图分类：液相酶免疫测定固相酶免疫测定以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸附试验（ELISA）是目前最为常用的固相酶免疫测定与均相不同之处需分离游离与结合的酶标记物二、异相酶免疫测定第三节　酶联免疫吸附试验三个部分：免疫反应

4、酶与底物反应检测方法的建立ELISA酶联免疫吸附试验（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）高纯度的抗原、高亲和力的抗体高活性、高纯度的标记用酶有效的交联方法制备高质量的酶标记物选用适宜的酶/底物系统分离结合与游离标记物的方法建立操作步骤以及研究自动化测定技术底物显色定性或定量的分析原理包被反应加入待测抗体或抗原和酶标抗原或抗体洗涤使结合在固相上的抗原抗体复合物与未结合的分离1234一、基本原理固相的抗原或抗体酶标记物酶反应的底物三个必要试剂二、方法类型及反应原理双抗体夹心法（do

5、ubleantibodysandwich-ELISA）方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，加底物显色应用：二价或二价以上的较大分子抗原测定(乙型肝炎表面抗原HBsAg),不能用于半抗原等小分子的测定。ELISA检测抗原的方法1、已知抗体包被于载体表面3、加酶标抗体与抗原结合4、加酶作用的底物产生颜色2、加待检物抗原与抗体结合4、加酶作用的底物不产生颜色洗涤洗涤洗涤洗涤双抗体夹心法测抗原1、已知抗体包被于载体表面2、加待检物无抗原与抗体结合3、加酶标抗体无抗原结合+-EEEEEEEEEELISA检测抗体的方

6、法捕获法原理：抗人IgMμ链抗体包被捕获待测标本中IgM类抗体加入特异性抗原和酶标记特异性抗原的抗体底物显色应用：病原体急性感染诊断中的IgM型抗体甲型肝炎HAV-IgM抗体乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗体洗涤洗涤洗涤洗涤捕获法原理+-EEEEE1、固相化抗人IgM1、固相化抗人IgM2、加待测物特异性IgM与非特异性IgM和抗人IgM结合3、加特异性抗原，与特异性抗体结合4、加酶标抗体与特异性抗原结合，加底物显色2、加待测物只有非特异性IgM和抗人IgM结合3、加特异性抗原，不能与非特异性IgM结合4、加酶标抗体无

7、抗原结合，加底物不显色第四节固相酶免疫测定的技术要点试剂的准备反应条件的选择操作的标准化一、试剂的准备（一）固相载体聚苯乙烯特点：吸附蛋白能力强，保留其免疫活性形状：小试管、小珠、微量ELISA板使用前检测其性能（二）抗原和抗体高纯度的Ag高效价的Ab一、试剂的准备（三）酶和底物的选择标记酶的要求：活性高性质稳定专一性强酶催化底物的显色信号易于判断和测量方法敏感，重复性好，简单易行酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉辣根过氧化物酶（HRP）糖蛋白（主酶）亚铁血红素（辅基）主酶与酶活性无关辅基是酶的活性中心RZ值：403n

8、m（辅基）　　　与275nm（主酶）OD值之比RZ值与酶活性无关，酶活性单位比RZ值更为重要ELISA中应用最为广泛的标记用酶常用酶HRP的底物DH2+H2O2→→→D+2H2OHRP供氢体DH2习惯上被称为底物，底物有多种H2O2为受氢体，HRP对受氢体的专一性很高（小分子醇和尿素的过氧化物）常用底物HRP的常见底物邻苯二胺OP