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时间:2018-01-27
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1、第十章 酶免疫技术本章考点 1.酶免疫技术的特点 2.酶免疫技术分类 3.酶联免疫吸附试验(ELISA) 4.膜载体的酶免疫测定 5.临床应用第一节 酶免疫技术的特点 酶免疫技术是利用酶催化底物反应的生物放大作用,提高特异性抗原-抗体免疫学反应检测敏感性的一种标记免疫技术。该技术所用的酶要求纯度高、催化反应的转化率高、专一性强、性质稳定、来源丰富、价格不贵、制备成的酶标抗体或抗原性质稳定,继续保留着它的活性部分和催化能力。最好在受检标本中不存在与标记酶相同的酶。另外它的相应底物应易于制备和保存,价格低廉,有色产物易于测定,光
2、吸收高。 一、酶和酶作用的底物 1.辣根过氧化酶(HRP):HRP在蔬菜作物辣根中含量很高,纯化方法也不复杂。它是一种糖蛋白,含糖量约l8%;分子量为44kD;是一种复合酶,由主酶(酶蛋白)和辅基(亚铁血红素)结合而成的一种卟啉蛋白质。主酶为无色糖蛋白,在275nm波长处有最高吸收峰;辅基是深棕色的含铁卟啉环,在403nm波长处有最高吸收峰。HRP对受氢体的专一性很高,除H202外,仅作用于小分子醇的过氧化物和尿素的过氧化物。后者为固体,作为试剂较H202方便。 许多化合物可作为HRP的供氧体,在ELISA中常用的供氢体底物为
3、邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)和ABTS。OPD为在ELISA中应用最多的底物,灵敏度高,比色方便。其缺点是配成应用液后稳定性差,而且具有致异变性。TMB无此缺点。TMB经酶作用后由无色变蓝色,目测对比鲜明;加酸停止酶反应后变黄色,可在比色计中定量;因此应用日见增多。ABTS,虽然灵敏度不如0PD和TMB,但空白值很低。 2.碱性磷酸酶(AP):是从牛肠粘膜或大肠杆菌中提取。从大肠杆菌提取的AP分子量为80kD,酶作用的最适pH为8.0;用小牛肠黏膜提取的AP分子量为l00kD,最适pH为9.6。一般采用对硝基苯磷酸酯(p
4、-NPP)作为底物。它可制成片状试剂,使用方便。产物为黄色的对硝基酚,在405nm有吸收峰。用NaOH终止酶反应后,黄色可稳定一段时间。 在ELISA中应用AP系统,其敏感性一般高于应用HRP系统,空白值也较低。但由于AP较难得到高纯度制剂,稳定性较HRP低,价格较HRP高,制备酶结合物时得率较HRP低等原因,国内在ELISA中一般均采用HRP。 3.其他的酶:有葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和脲酶等。β-半乳糖苷酸的底物常用4-甲基伞基-β-半乳糖苷,经酶水解后产生荧光物质4-甲基伞酮,可用荧光计检测。荧光的放大作用大大提高了方法的
5、敏感度。AP也可应用可产生荧光的伞基磷酸酯作底物。其缺点是需要荧光计测定,而且如用固相载体直接作为测定容器,此载体不可发出荧光。脲酶的特点是酶作用后反应液发生pH改变,可使指示剂变色;另外,在人体内没有内源酶。 二、酶标记抗体或抗原 酶标记的抗原或抗体称为结合物(conjugate)。抗原由于化学结构不同,可用不同的方法与酶结合,如为蛋白质抗原,基本上可参考抗体酶标记的方法。制备抗体酶结合物的方法通常有以下几种。 1.戊二醛交联法:戊二醛是一种双功能团试剂,可以使酶与蛋白质或其他抗原的氨基通过它而偶联。戊二醛交联可用一步法(如连接
6、AP),也可用二步法(如连接HRP)。戊二醛一步法操作简便、有效,而且重复性好。缺点是交联时分子间的比例不严格,大小也不一,影响效果。制备HRP抗体结合物也可用二步法,即先将HRP与戊二醛作用,透析除去戊二醛,在pH9.5缓冲液中再与抗体作用而形成酶标抗体。此法的效率可高于一步法l0倍左右。 2.过碘酸盐氧化法:本法只用于HRP的交联。该酶含18%碳水化合物,过碘酸盐将其分子表面的多糖氧化为醛基。用硼氢化钠(NaBH4)中和多余的过碘酸。酶上的醛根很活泼,可与蛋白质结合,形成按摩尔比例结合的酶标结合物。有人认为此法为辣根过氧化物酶交联
7、最有效的方法。但也有只认为由于所用试剂较为剧烈,各批实验结果不易重复。 按以上方法制备的结合物一般混有未结合的酶和抗体。理论上结合物中混有游离酶不影响ELISA中最后的酶活性测定,因经过洗涤,非特异性吸附于固相上的游离酶已被洗去。但游离的抗体则会与酶标抗体竞争相应的固相抗原,因而减低结合到固相上的酶标抗体量。因此制备的结合物应予以纯化。纯化的方法较多,分离大分子混合物的方法均可应用。硫酸铵盐析法操作简便,但效果不如用sephadexg-200凝胶过滤的好。 3.标记抗体鉴定:通常采用棋盘滴定法进行筛选,见第十九章。 三、固相载体
8、 酶免疫技术的主要试剂为固相的抗原或抗体、酶标记的抗原或抗体和与标记酶直接关联的酶反应底物。可作固相载体的物质很多,最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能,抗体或蛋白质抗原吸附其上后保留原来
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