八珍颗粒微生物限度检查法验证

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1、八珍颗粒微生物限度检查法验证摘要：目的建立八珍颗粒微生物限度检查方法并进行验证。方法按《中国药典》2010年版一部的要求，对细菌、霉菌及酵母菌计数方法和控制菌检查方法进行验证。结果八珍颗粒可按常规法进行微生物限度检查。结论为保证药品的微生物污染能被检出，应对药品的微生物限度检查进行验证。关键词：八珍颗粒微生物限度检查方法验证八珍颗粒由党参、炒白术、茯苓、炙甘草、当归、炒白芍、川莒、熟地黄八种中草药组成，用于气血两亏，面色萎黄，食欲不振，四肢乏力，月经过多。为保证微生物限度检查结果的可靠有效，应对检查进行方法验证，保证药品的微

2、生物污染能被检出。1.试药、仪器与培养基1.1试药八珍颗粒(宁波利华制药有限公司，批号：130204)1.2仪器电热恒温培养箱，电子天平，高压蒸汽灭菌器。1.3实验用菌种大肠埃希菌［CMCC(B)44102］、金黄色葡萄球菌［CMCC26003］、枯草芽胞杆菌［CMCC［B)63501］、白色念珠菌［CMCC(F)98001］、黑曲霉［CMCC(F)98003］,以上均为购自山东省食品药品检验所的第三代菌种。1.4培养基营养琼脂培养基(1103162),玫瑰红钠培养基(110222),营养肉汤培养基(101215),改良马丁

3、培养基(110211),pH7.0氯化钠蛋白豚缓冲液(1103232),北京三药科技开发公司；胆盐乳糖培养基(20130326),MUG培养基(20121126),青岛高科园海博生物技术有限公司。1.5供试液制备取供试品10g,加pH7.0无菌氯化钠-蛋白脓缓冲液至100ml,混匀，作为1：10的供试液。2•细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证2.1菌液制备取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，34£培养24小时，取白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，26*培养24小时,上述培养物用0.9

4、%氯化钠溶液稀释到50-100cfu/ml的菌悬液备用；取黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，26°C培养7天，加入5ml含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将胞子洗脱，吸出胞子悬液至无菌试管，用含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液稀释到50-100cfu/ml的孑包子悬液备用。1.2细菌计数方法验证[1]1.2.1试验组取1：10的供试液lml注入平皿中，再分别注入lml2.1中制备好的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽砲杆菌菌悬液，倾注营养琼脂培养基。2.2.2菌液组各取lml2.1中

5、制备好的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽砲杆菌菌悬液，分别注入平皿中，倾注营养琼脂培养基。2.2.3供试品对照组取1:10的供试液lml注入平皿中,倾注营养琼脂培养基。2.3霉菌及酵母菌计数方法验证[1]2.3.1试验组取1：10的供试液lml注入平皿中，再分别注入lml2.1中制备好的白色念珠菌菌悬液和黑曲霉鞄子悬液，倾注玫瑰红钠琼脂培养基。2.3.2菌液组各取lml2.1中制备好的白色念珠菌菌悬液和黑曲霉胞子悬液，分别注入平皿中，倾注玫瑰红钠琼脂培养基。2.3.3供试品对照组取1：10的供试液lml注入平皿中，倾注玫瑰

6、红钠琼脂培养基。各试验菌分别进行3次独立的平行试验，分别计算各试验菌每次实验的回收率。各组计数及试验组的菌数回收率见表lo2.4结果表1显示5株试验菌株的3次回收率均高于70%,八珍颗粒可用常规法进行细菌、霉菌及酵母菌计数。3控制菌检查方法验证[1]1.1菌液制备取大肠埃希菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，34工培养24小时，上述培养物用0.9%氯化钠溶液稀释到50-100cfu/ml的菌悬液备用。3.2供试品组取1：10供试液10ml接种至100ml胆盐乳糖培养基中，34°C培养24小时，取上述培养物0.2ml至5m1MU

7、G培养基试管中，于5小时、24小时在366nm紫外光下观察；沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液，观察液面颜色。1.3试验组取1：10供试液10ml、3.1中制备好的大肠埃希菌菌悬液lml(50-100cfu)接种至100ml胆盐乳糖培养基中，方法同3.2o3.3阳性对照实验取3.1中制备好的大肠埃希菌菌悬液lml(50T00cfu)至100ml胆盐乳糖培养基中，方法同1.2O3.4阴性对照实验取pH7.0无菌氯化钠蛋白淼缓冲液10ml至100ml胆盐乳糖培养基中，方法同3.2。观察结果见表23.5结果试验组检出大肠埃希菌，表明

8、八珍颗粒可用常规法进行控制菌检查。4讨论通过方法验证，八珍颗粒可以采用常规平皿法进行细菌、霉菌和酵母菌计数，可用常规法进行控制菌检查。由于微生物限度检查易受试验条件的影响，中国药典规定要进行方法验证，以确保在检验条件下被污染的微生物能被检出，因此所有药品的微生物限度检查均需进行方法验证，确