微生物限度和无菌检查法验证

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1、微生物限度和无菌检查法验证微生物限度和无菌检查法验证意义：中国药典2000年版及以前的版本虽然收载了微生物限度检查法和无菌检查法，但在如何保证检验方法的科学性及检验结果的准确性方面存在一些问题，与国外药典的相关要求比较有一定差距，关键是未明确对检验方法进行必要的方法学验证。以前品种的申报资料中一般仅提供微生物限度检查或无菌检查的检查结果，无方法学验证内容。但从保证药品安全性的实际出发，不同品种需要选择建立各自适当的检查方法，即使是仿制药，由于不同生产企业采用的工艺、辅料等的不同，其产品可能表现出不同的抑菌特性，进行

2、微生物限度检查或无菌检查时，具体的检查方法也不能简单地照搬，需要通过试验验证核实已有的试验方法和检测系统是否适用，因此，也需要进行必要的方法验证。中国药典2005年版对微生物限度检查法和无菌检查法进行了修订完善，明确规定进行药微生物限度和无菌检查法验证目的是确认试验中应选择药典收载的何种供试液制备方法、何种测定方法，以及验证确定的检测系统是否适用于该药品的检验。如果供试品有抑菌性，影响测定结果，则应采用适当的方法消除供试液的抑菌活性后再进行检查。也就是说，只有通过方法验证，才能确定针对具体品种的具体的检验方法，保证

3、采用的方法的科学性和检验结果的准确性。方法验证的思路首先了解供试品是否有抑菌性、抑何种菌，再考虑选择适当的方法消除或降低供试品的抑菌性，然后用试验验证所采用的方法已经消除了抑菌性（能使人工加入的各种试验菌生长良好），特别是能满足对产品最敏感菌的生长；最后将所作的试验记录在案，形成确认该供试品在该检验量及该检验条件下，已充分消除抑菌性，能确保试验结果准确可靠的验证报告。微生物限度和无菌检查方法验证试验可概括描述为：在采用的检验方法和过程中，通过分别加入规定量的代表性微生物，以验证供试品是否在规定的检验量、在所采用的

4、检验条件下无抑菌性，或已充分消除了抑菌性（供试品本身的以及操作系统中可能对微生物生长有影响的各种因素），并且所用方法对微生物生长无不良影响，从而确认检验方法的有效性，保证检验结果的准确可靠。整个试验过程中的每一个环节均应有合理的证明，保证其对结果的判断没有影响。方法验证的重点1、验证制成适宜供试液的前处理方法，证明方法对微生物生长、检出无影响。2、验证样品有无抑菌性、抑什么菌？最敏感的菌是那一个？其结果将直接影响后续检验方法的选择和操作步骤的进行，同时是最终所选检验方法和操作步骤合理性的证明。3、验证消除样品抑菌性

5、的方法，证明方法的有效性及方法对污染菌生长无影响；如何选择合理、适宜、简单有效的消除抑菌性的方法是当前验证工作的关键。方法验证的步骤与内容1、制备验证试验用菌液按药典无菌检查法中培养基灵敏度检查项中试验用菌液的制备方法将规定需用的试验菌分别制成每毫升中含10～100个菌（CFU）的供试菌液。2、样品的前处理方法样品的前处理方法是验证试验的一部分，需证明所用的处理方法对各试验菌的生长无影响。根据供试品的性状，选用以下适宜的方法，或几种方法联合使用：溶解：验证所用溶液、助溶剂和水浴助溶温度对微生物的生长无影响。

6、乳化：验证所用乳化剂和水浴助溶温度的有效性、使用量及对微生物的生长无影响。破乳：验证所用破乳剂的有效性、使用量及对微生物的生长无影响。萃取：验证有机相选择的合理性、有效性及对微生物的生长无影响。稀释：验证降低供试品相对抑菌浓度的有效稀释倍数。离心：验证所用转速、时间和微生物的分布情况。应说明采取某种前处理方法的原因，如样品不需要特别的前处理就能制成均匀的供试液，这一步可以省掉，直接进入确定样品有无抑菌性的步骤。确定供试品是否有抑菌性、抑什么菌？通过文献资料或申报资料中的药效学资料，了解其对不同细菌的MI

7、C，参考已经验证过的品种、抗菌药物可根据抗菌谱确定敏感菌、中成药抗菌谱不清楚，至少需选择一株细菌和一株真菌来试验。也可以直接通过验证试验确定抑菌性。试验确定抑菌性的方法：在规定量的供试液中加入试验用微生物10～100个，如微生物生长良好，说明供试品对该种微生物无抑菌活性。如已用药典规定的各试验菌进行了试验，结果均能生长良好，说明供试品无抑菌性，可用常规方法检验。如加入的微生物不生长或生长缓慢，说明供试品有抑菌性；如加入的微生物中有某一种菌最不能生长或生长最缓慢，这一种菌就是该样品的敏感菌。选择适当的方法消除或有效

8、降低供试品的抑菌性根据供试品的特性选择药典规定的消除其抑菌性的方法（一种或几种方法联合），或根据药物的化学特性，寻找出其他合理、有效的方法，特别是有效的中和剂；并通过模拟试验（验证试验）对消除或降低抑菌性的效果进行检验。无菌检查可采用：①薄膜过滤法；②中和法（目前药典仅收载β-内酰胺酶处理法）。①薄膜过滤法适用于液体供试品和可溶于水的固体供试品（只要许