第6章 蛋白质的分子结构

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1、第三节：蛋白质的分子结构一、蛋白质的一级结构二、蛋白质的二级结构和纤维状蛋白三、蛋白质的三级结构四、蛋白质的四级结构蛋白质的结构蛋白质是由一条或多条多肽(polypeptide)链以特殊方式结合而成的生物大分子。蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是将分子量在6000道尔顿以上的多肽称为蛋白质。蛋白质分子量变化范围很大,从大约6000到1000000道尔顿甚至更大。一、蛋白质的一级结构1.定义——1969年，国际纯化学与应用化学委员会（IUPAC）规定：蛋白质的一级结构指蛋白质多肽连中AA的排列顺序，包括二硫键的位置。其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生

2、物功能的基础。2.蛋白质一级结构的测定蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。a、样品必需纯（>97%以上）；b、知道蛋白质的分子量；c、知道蛋白质由几个亚基组成；（1）测定蛋白质一级结构的要求(2)测定步骤A.测定蛋白质分子中多肽链的数目。通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。蛋白质一级结构的测定（2）测定步骤B.多肽链的拆分。由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。蛋白质一级结构的测定(2)测定步骤B.多

3、肽链的拆分。几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍或高浓度盐处理，即可分开多肽链(亚基)。蛋白质一级结构的测定(2)测定步骤C.二硫键的断裂几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇(还原法)处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂（如，ICH2COOH）保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。蛋白质一级结构的测定SH-CH2-CH2-OH(2)测定步骤可以通过加入盐酸胍方法解离多肽链之间的非共价力；应用过甲酸氧化

4、法拆分多肽链间的二硫键。蛋白质一级结构的测定ssHcoooHSO3HSO3H作用：这些反应可用于巯基的保护。巯基（-SH）的保护SSSSSS胰岛素HO-CH2-CH2-SHSHSHSHSHSHSHSCH2C00HSCH2C00HSCH2C00HSCH2C00HSCH2C00HSCH2C00HICH2COOH-巯基乙醇二硫键的断裂巯基（-SH）的保护(2)测定步骤D.分析多肽链的N-末端和C-末端。多肽链端基氨基酸分为两类：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸。在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。蛋白质一级结构的测定Sa

5、nger法。2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP-多肽或DNP-蛋白质）。DNP-多肽在酸性条件下水解，只有N-末端氨基酸为黄色DNP-氨基酸衍生物，其余的都是游离氨基酸。只要鉴别所生成的DNP-氨基酸，就可得知N-末端氨基酸。该产物能够用有机溶剂（如乙醚、乙酸乙酯）抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。N-末端基氨基酸测定二硝基氟苯（DNFB）法在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯，DNS）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，

6、检测灵敏度可以达到110-9mol，比DNFB法高100倍。DNS-氨基酸不需要抽提，可直接用纸电泳或者薄层层析加以鉴定。N-末端基氨基酸测定丹磺酰氯法多肽或蛋白质的末端氨基也和氨基酸的α-氨基一样能与PITC（Edman试剂）作用，生成苯氨基硫甲酰多肽或蛋白质，简称PTC-多肽或PTC-蛋白质。后者在酸性有机溶剂中加热时，N一末端的PTC一氨基酸发生环化，生成苯乙内酰硫脲的衍生物并从肽链上掉下来，除去N-末端氨基酸后剩下的肽链仍然是完整的，因为PTC基的引入只使第一个肽键的稳定性降低。反应液中代表N-末端残基的PTH-氨基酸，经有机溶剂抽提干燥后，可用薄层

7、层折、气相色谱和HPLC等进行鉴定。此方法还可以用来测定氨基酸序列。N-末端基氨基酸测定氨肽酶是一类肽链外切酶或叫外肽酶，它们能从多肽链的N－末端逐个地向里切。根据不同的反应时间测出酶水解所释放的氨基酸种类和数量，按反应时间和残基释放量作动力学曲线，就能知道该蛋白质的N-末端残基序列。实际上此法用于测定N一末端和末端残基序列有许多围难，困为酶对各种肽键敏感性不一样，常常难以判断哪个残基在前，哪个残基在后。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶（LAP），亮氨酸氨肽酶不是只能水解以Leu为N-末端残基的肽键，只是水解以Leu为N-末端的肽键速度为最大。氨肽酶法N-末端基氨

8、基酸测定在蛋白质或多肽的氨基酸序列测定