实验二总糖和还原糖的测定

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1、实验二总糖和还原糖的测定(3，5～二硝基水杨酸法)《食品生物化学实验》课程掌握3，5～二硝基水杨酸法测定待测样品的总糖和还原糖含量的基本原理，学会处理721型或722型分光光度计出现的问题一、实验目的二、实验原理还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。本实验是利用

2、3，5～二硝基水杨酸溶液（DNS法）与还原糖溶液共热后被还原成棕红色氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和棕红色物质深浅的程度成一定比例关系，可用于比色测定。操作简便，快速，杂质干扰较少。三、实验步骤1、葡萄糖标准曲线的制定葡萄糖标准液的配制：准确称取100mg分析纯的无水葡萄糖（预先在105℃干燥至恒重），用少量蒸馏水溶解后，定量转移到100ml容量瓶中，再定容到刻度，摇匀。浓度为1mg/ml。取7支25×250mm的试管，分别按下表加入试剂：管号0123456葡萄糖标准液（ml）00.20.40.60.81.01.2相当于葡萄糖量(mg)00.20.40.60.81.01.2

3、蒸馏水（ml）2.01.81.61.41.21.00.83,5二硝基水杨酸(ml)1.51.51.51.51.51.51.5将各管溶液混合均匀，沸水浴加热5min，取出后立即用冷水冷却到室温，再向每管加入21.5ml蒸馏水，摇匀。于520nm波长处测定OD值。以葡萄糖毫克数为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线。2、样品中总糖和还原糖含量的测定（1）样品中还原糖的提取：准确称取10g新鲜材料（或2g材料干样粉末），放在100ml烧杯中，先以少量水调成糊状，然后加50～60ml蒸馏水，于50℃恒温水浴中保温20min，过滤，将滤液收集在100ml容量瓶中，再定容至100ml。（

4、2）样品中总糖的水解提取：准确称取10g新鲜材料（或1g材料干样粉末），放在锥形瓶中，加入10ml6mol•L-1盐酸，15ml水，在沸水浴中加热30min，取出一、二滴置于白瓷板上，加1滴碘～碘化钾溶液检查水解是否完全。如已水解完全，则不呈现蓝色。冷却后加入1滴酚酞指示剂，以10%氢氧化钠溶液中和至溶液呈微红色，过滤并定容到100ml。再精确吸取上述溶液10ml于100ml容量瓶中，定容至刻度，混匀备用。（3）样品中糖含量的测定：取7支25×250mm试管分别按下表加入试剂：管号空白还原糖总糖0123123样品溶液（ml）01.01.01.01.01.01.0蒸馏水（ml）

5、21.01.01.01.01.01.03,5二硝基水杨酸(ml)1.51.51.51.51.51.51.5OD加完试剂后，与制作标准曲线时相同的操作测定样品糖含量。四、实验结果在Excel绘制葡萄糖标准曲线，并求出标准线性方程。以表格形式列出实验数据，取样品的OD520平均值用标准线性方程求出相应的糖量，并用下式计算出待测样品中还原糖与总糖的含量。还原糖（mg•g-1）=还原糖毫克数×提取液总体积（ml）×稀释倍数测定用提取液体积（ml）×样品重量（g）总糖（mg•g-1）=样品水解后还原糖毫克数×提取液总体积（ml）×稀释倍数测定用提取液体积（ml）×样品重量（g）五、讨论分

6、析1、在被测样品中，还原糖可能是些什么糖？总糖包括哪些？2、用来测定总糖的样品，为什么要加盐酸水解？而在其测定前，又为何要用NaOH中和？3、标准葡萄糖浓度梯度和样品含糖量的测定为什么应该同步进行？比色时设0号管有什么意义？六、改进实验建议附：仪器和试剂主要仪器：分光光度计，水浴锅，容量瓶，刻度试管，移液管等。3,5-二硝基水杨酸试剂：甲液：溶解6.9g结晶酚于15.2ml10%氢氧化钠溶液中，并用水稀释至69ml，在此溶液中加6.9g亚硫酸氢钠。乙液：称取255g酒石酸钾钠加到300ml10%氢氧化钠溶液中，再加入880ml1%3,5-二硝基水杨酸溶液。将甲乙二溶液混合即得黄

7、色试剂，贮于棕色瓶中备用。在室温放置7-10天后使用。6mol•L-1盐酸10%氢氧化钠溶液酚酞指示剂碘～碘化钾溶液：称取5g碘，10g碘化钾溶于100ml蒸馏水中。