第14章+基因重组和基因工程.PPT

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1、天津医科大学生化教研室解用虹重组DNA技术教学要求熟悉基因工程（重组DNA技术）产生的理论和技术基础，以及基因工程开展的积极意义。2.掌握以质粒为代表的载体的结构特点和实际应用。3.掌握以限制性核酸内切酶为重点的一系列工具酶和宿主细胞的概念，特点和实际应用。4.熟悉完整的基因工程的过程，步骤和原理。5.了解重组DNA技术在医学中的应用和其广泛应用前景。重组DNA技术第一节概述第二节重组DNA基本原理第三节重组DNA技术在医学中的应用第一节概述一.基因工程建立和发展的基础二.面临新挑战，解决新问题三.相关的基本概念一.基因工程建立和发展的基础1.分子生物学的理论发展DNA结构和功能的深入认识遗传

2、信息中心法则的确立2.分子生物学的技术进步限制性内切酶等工具酶的发现载体的发现和构建3.分子生物学的发展要求基因的结构和序列基因功能和调节新DNA分子的构建二.面临新挑战解决新问题1.基因的结构2.基因的功能3.基因表达调节4.基因工程产品5.构建新基因三.相关的基本概念1.克隆2.目的基因3.载体4.工具酶5.宿主细胞1.克隆（clone）1.克隆是指来自同一始祖的一群相同分子(如DNA)、细菌(如大肠杆菌)、细胞(如杂交瘤细胞)或动物(如羊)的集合。2.这种由单一始祖获取大量副本或拷贝的过程称为克隆化3.分子生物学和分子遗传学所涉及的分子克隆专指DNA克隆2.目的基因(targetDNA)

3、1.目的基因就是我们感兴趣，待研究或应用的基因，目的基因又称目的DNA.2.目的基因可分为两种类型基因组DNAcDNA(互补DNA)3.载体(vector)1.载体的概念2.载体应具备的特征3.常见的基因工程载体⑴.载体的概念载体是指能够容纳目的基因而且具有自我复制能力，同时又能携带目的基因进入宿主细胞，并能大量扩增目的基因或能表达有意义的蛋白质的DNA分子。前者称克隆载体，后者称表达载体。⑵.理想载体应具备的特征1.自身含有复制子，具有自主复制的能力2.在宿主细胞能够稳定地遗传3.有合适的分子量，易于操作但又能容纳较大分子的目的基因，同时便于与宿主染色体分离具有便于应用的多克隆位点，便于目的

4、基因的插入5.具有一个或多个遗传标致作为筛选标记作为表达载体应具有与宿主细胞相适应的启动子等调节元件⑶.常用的基因工程载体质粒噬菌体黏粒病毒穿梭质粒其他载体：(BAC和YAC)①.质粒(plasmid)1.质粒是存在于细菌染色体外的，具有在宿主细胞内自主复制能力的环状双链DNA分子。2.工程质粒载体不是天然质粒，是人工构建的质粒。通过人工构建赋予了质粒许多作为基因载体的特征。质粒（plasmid）是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。大小约为数千碱基对。常有1~3个抗药性基因，以利于筛选。质粒载体的基本特征1.具有复制起始点和自主复制能力2.细胞分裂时，能稳定地遗传给子代3.带有独特的

5、遗传信息（抗药性等）4.具有酶切位点（携带外源DNA）5.分子量远小于染色体（便于分离）6.一般可接受小于10Kb的外源基因克隆载体—pUC18/19表达载体—pGEX-3X②.噬菌体(bacteriophage)1.噬菌体是细菌病毒，它可以感染细菌。2.噬菌体由基因组DNA和包装蛋白质组成。3.噬菌体DNA一般可有双链线状DNA（如噬菌体）和单链环状DNA（如M13）③.其它载体黏粒病毒穿梭质粒其他载体：(BAC和YAC)4.工具酶1.工具酶是能对基因进行加工和处理的酶类2.常用的工具酶有限制性核酸内切酶DNA聚合酶DNA连接酶逆转录酶其它的工具酶⑴限制性核酸内切酶1.定义2.分类3.命名

6、4.酶切位点5.酶切末端①.限制性内切酶--定义1.能识别和切割DNA双链内部特异核苷酸序列的一类核酸内切酶。2.核酸内切酶是原核细胞识别和破坏外源DNA分子的初级免疫形式。3.原核细胞具有限制性/甲基化系统，通过甲基化保护自身的DNA不被破坏②.限制性内切酶分类1.限制性内切酶可分为三类：Ⅰ类，Ⅱ类和Ⅲ类。2.基因重组技术中使用的是Ⅱ类。3.Ⅱ类限制性内切酶的酶切位点多在识别的序列内。③.限制性核酸内切酶命名EcoRⅠEcoRⅠ1.核酸内切酶命名一般由四部分组成。2.第一部分一个斜体的大写英文字母表示来源菌的属（Escherichia）。3.第二部分二个斜体的小写英文字母表示来源菌的种（c

7、oli）4.第三部分正写英文字母表示来源菌的株R5.第四部分大写罗马数字表示发现的顺序Ⅰ④.酶切位点--回文结构1.Ⅱ类核酸内切酶识别位点或称识别序列多为回文结构2.所谓回文结构即DNA的两条链从5’向3’阅读时具有相同的序列3.如HindⅢBamHⅠ⑤.酶切末端1.经核酸内切酶切割后可产生二类末端：黏性末端和平端2.黏性末端可分为5’突出黏性末端和3’突出黏性末端限制性核酸内切酶作用后产生两种末