基因重组与基因工程.ppt

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1、五、基因重组与基因工程（一）重组DNA技术的基础（二）重组DNA技术的基本操作过程（三）重组DNA技术的应用（一）重组DNA技术的基础重组DNA技术的定义在体外，将一种外源DNA和载体DNA重新组合连接，形成杂交DNA，然后将其转入宿主细胞，最终使外源DNA在宿主细胞中随着宿主细胞的繁殖而增殖和表达,从而改变生物原有遗传性状的过程，称为重组DNA技术。它是按生物科学规律，在体外人为的改造基因，最终往往使生物的遗传性状获得改变，故又称为“遗传工程”，亦即“基因工程”。1.重组DNA技术的基础(1)重要的工具酶(2)载体（1）重要的工具酶它能够识别、切割双

2、链DNA分子中的特定序列，这些特定序列多数为反向重复序列，一般长度是4、5或6bp。①限制性内切酶①粘性末端如EcoRI:5’---GAATTCCTTAAG---3’②平齐末端如HaeIII:5’---GGCCCCGG---3’PGAATTCQP'CTTAAGQ'XGAATTCYX'CTTAAGY'AATTCQPGP'CTTAAGQ'XGAATTCYX'CTTAAGY'P'CTTAAPGAATTCYGY'X'CTTAAXGGQ'AATTCQEcoR1限制性酶酶切片段退火与DNA连接酶连接②DNA连接酶目前使用的连接酶有两种：大肠杆菌DNA连接酶黏性末端

3、连接；T4连接酶黏性和平齐末端连接。（2）载体概念能将外源DNA带入宿主细胞，进行复制扩增或最终使外源基因得以表达的自主DNA，称为载体（vector）。分类①克隆载体用于基因的复制、扩增、测序等；②表达载体用于目的基因的表达。（二）重组DNA技术的基本操作过程1.目的基因的获得2.选择和制备载体3.将目的基因与载体进行切割连接4.将重组体导入受体细胞5.阳性克隆的筛选和鉴定6.DNA重组体的扩增、表达等研究重组DNA技术的基本操作过程1.目的基因的获得（1）提取DNA后，PCR体外特异扩增（2）以mRNA为模板，反转录合成cDNA。（3）化学合成基因

4、（4）限制性内切酶从载体上切取（5）构建基因文库，调取目的基因2.载体的选择和制备原核生物常用的载体：质粒和噬菌体；真核生物常用的载体：动物病毒、酵母；穿梭载体：通常是指那些既能在真核细胞中繁殖又能在原核细胞中繁殖的载体。目的基因与载体的酶切与连接3.4.重组DNA导入宿主细胞大肠杆菌、酵母、真菌及各种真核细胞、受精卵细胞都可用于重组。转化转染--------5.目的基因的筛选和鉴定（1）遗传学方法（2）核酸杂交法（3）PCR方法（4）酶切鉴定（1）遗传学方法利用载体的特殊标记如质粒含有抗青霉素的基因，当含外源DNA的质粒转化后可在含有青霉素的培养基中

5、生长，而未转入质粒的细菌在同样的条件下不能生长。（2）核酸杂交法菌落原位杂交23626（3）多聚酶链式反应20世纪80年代末发展起来的一种DNA特定片段体外快速合成扩增的方法，称多聚酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）。PCR技术具有高度的灵敏性和特异性，能在极短的时间内将目的基因扩增至数百万倍，通过琼脂糖凝胶电泳，可以直接观察产物的存在。因此，PCR技术对于鉴定阳性克隆十分有效，而且无需制备DNA。（4）酶切鉴定目的基因表达6.（三）重组DNA技术的应用1.DNA指纹技术2.转基因动物与动物克隆3.基因诊断与基因治疗1

6、.DNA指纹技术DNA指纹(DNAfingerprint)技术是20世纪70年代末发展起来的遗传标记的方法。遗传标记（geneticmarker）是指可用来区分不同群体或个体，又能稳定遗传的某些物质。生物个体间的差异在本质上是DNA的差异，因此DNA是最可靠的遗传标记。（1）限制性片段长度多态性真核生物的DNA分子很长，在遗传过程中DNA碱基由于替换、重排、插入、缺失等原因，在子代DNA中会引起差异形成多态性。当用一种限制性内切酶去切DNA时，DNA分子会降解成许多长短不等的片段，个体间这些片段是特异的，可以作为某一DNA（生物）的标记，将这种方法称为

7、限制性片段长度多态性（restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP）。个体1个体2在人体DNA文库中发现的由9–70bp重复单位串联重复排列而成的高变异区，称为小卫星DNA（minisatelliteDNA）。不同个体的多态性来源于重复单位的重复次数不同，同一家族小卫星重复单位含有相同或相似的核心序列，用某一小卫星DNA作探针，可与同一或不同物种多酶切DNA片段杂交，获得DNA指纹图谱（DNAfingerprint）。所有真核生物基因组中还存在由2-6bp为重复单位的重复顺序，因其重复单位比小卫星短，称为微卫星D

8、NA（microsatelliteDNA）。真核生物的小卫星DNA人的DNA指纹图谱（2）随机