基因重组和基因工程(II)

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1、基因工程与基因体外表达GeneticEngineeringandgeneexpressioninvitro第13章重组DNA技术的发展史1865年G.J.Mendel的豌豆杂交试验。1944年O.T.Avery的肺炎球菌转化实验。1973年美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子。1977年美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。1980年开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂。1997年英国罗林研究所成功的克隆了多莉。1972年,P.Berg:构建第一个DNA重组分子1997年

2、,动物克隆:克隆羊多莉1977年，基因工程产品的出现H.W.Boyer,第一个基因工程产品(SS)1973年,S.S.Cohen:第一个基因克隆实验2001年，人类基因组计划一、重组DNA技术相关概念克隆(clone):来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。（一）DNA克隆技术水平：分子克隆(molecularclone)（即DNA克隆）细胞克隆个体克隆（动物或植物）应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能

3、力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA(recombinantDNA)。DNA克隆生物技术工程:基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等。目的：①分离获得某一感兴趣的基因或DNA②获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）基因工程(geneticengineering)——实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学。重组DNA技术基本原理基本原理目的基因的获取DNA导入受体细胞外源基因与载体的连接克隆载体的选择

4、和构建重组体的筛选克隆基因的表达第一节基因克隆是利用工具酶进行操作关键步骤一的工具：关键步骤二的工具：关键步骤三的工具：基因的剪刀——限制酶基因的针线——DNA连接酶基因的运载工具——运载体工具酶限制性核酸内切酶DNA聚合酶Ⅰ逆转录酶T4DNA连接酶碱性磷酸酶末端转移酶TaqDNA聚合酶限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease)限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)是识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ定

5、义：与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）分类：作用：第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。命名：HindⅢ属系株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶Ⅱ类酶识别序列特点——回文结构(palindrome)切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGII型限制性核酸内切酶：能识别DNA分子内部的特异性位点和切割双链DNA，其切割位点的序列可知、固定。BamH

6、ⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ同功异源酶：有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCC

7、G++ATCTAGGATCTA同尾酶名　　称　　　识别序列及切割位点名　　称　　　　　识别序列及切割点切割后产生５’突出末端:BamHⅠ5’…G▼GATCC...3’BglⅡ5’…A▼GATCT...3’EcoRⅠ5’…G▼AATTC...3’HindⅢ5’…A▼AGCTT...3’HpaⅡ5’…C▼CGG...3’MboⅠ5’…▼GATC...3’NdeⅠ5’…GA▼TATG...3’切割后产生3’突出末端:ApaⅠ5’…GGGCC▼C...3’HaeⅡ5’…PuGCGC▼Py...3’KpnⅠ5’…GGTAC▼C...3’PstⅠ5’…CTGCA▼G

8、...3’SphⅠ5’…GCATG▼C...3’切割后产生平末端:AluⅠ5’…