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1、Pim-1在人宫颈鳞癌组织中的表达及临床意义【摘要】目的：研究Pim-l基因及其蛋白在宫颈鳞癌组织屮的表达水平，探讨其与宫颈鳞癌临床特性之间的关系。方法：采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）半定量方法和免疫组化学法，检测46例宫颈鳞癌组织和10例正常宫颈组织标本中Pim-1基因及蛋白的表达情况。结果：宫颈鳞癌组织中Pim-1基因与蛋白的表达水平明显高于宫颈正常组织（P<0.05）；Pim-1蛋白在宫颈鳞癌组织屮的表达与组织学分级、临床分期和淋巴结转移密切相关（1X0.05）。结论：原癌基因Pirn-1及其蛋白在宫颈鳞癌组织中过度表达，可能与宫颈鳞癌的发生、发展有关。【关键词】
2、宫颈鳞癌;反转录-聚合酶链反应;免疫组化；Pim-1基因Pim-1基因最早在莫洛尼小鼠白血病病毒诱导的T-细胞淋巴瘤中被发现的[1],其编码的Pim-1蛋白激酶具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性，参与调节细胞增殖、分化与凋亡等。已有大量的研究表明Pim-1在人类多种肿瘤组织中高表达。但关于PimT在宫颈癌组织中的表达情况研究报道甚少。本研究应用RT-PCR方法和免疫组化学法分别检测了Pim-1基因和其蛋白在宫颈鳞癌中的表达情况，初步探讨了Pim-1基因与宫颈鳞癌发生、发展的关系，并且为以后深入研究提供了相关理论依据。1材料与方法1.1标本来源所有标本均来自郑州大学第一附属医院妇产科2
3、009-2011年手术治疗口术后经病理科证实为宫颈鳞癌患者46例（恶性组）、多发性子宫平滑肌瘤患者10例（正常组），所选患者术前均未进行放疗和化疗。取所冇入选病例术屮切除的新鲜宫颈组织标本，均分作两份,一份立即放入液氮中保存，用于做RT-PCR实验；另一份用福尔马林溶液固定、石蜡包埋，用于做免疫组化实验。1.2试剂RT-PCR所用试剂盒均购自北京全式金生物技术有限公司，引物是由北京赛百盛生物技术有限公司合成：Pim-1上游引物序列为5,CGATGGGACCCGAGTGTA3',下游引物序列为5'TGGAGGTGGATCTCAGCAGT3',扩增片段为312bp；内参照3-acti
4、n的上游引物序列为5,CTGGGACGACATGGAGAAAA3'，下游引物序列为5'AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC3',扩增片段为564bp0SP试剂盒和DAB显色剂购于北京中杉金桥生物技术有限公司，兔抗人单克隆抗体Pim-1购于美国EPITOMICS公司。1.3实验方法1.3.1RT-PCR取约100mg宫颈组织,按Trizol提取试剂盒说明提取各组织总的RNA,紫外分光光度计检测RNA的纯度和浓度，反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNAo取逆转录产物2?L,按PCR试剂盒说明进行。PimT引物扩增条件为：94°。预变性2min,1个循环；94°C变性30s,56°
5、C退火30s,72°C延伸2min,共30个循环；72°C总延伸6mino取上述扩增产物5?L与缓冲液混合后加入2%琼脂糖凝胶的加样孔中，进行电泳。EB染色，用紫外线投射仪观察电泳条带，拍照并记录，用D-140图像记录分析系统进行分析，得出Pim-1mRNA相对表达量。以正常宫颈组织作为対照。1.3.2免疫组化采用免疫组化链霉索抗生物素蛋口-过氧化物酶(SP)法检测Pim-1蛋白的表达，具体操作按试剂盒说明书进行。染色结果判定：Pim-1在光镜下进行分析，随机选择5个高倍视野共计数200个细胞，在排除非特界性染色的前提下，胞浆/胞核出现淡黄色至黄棕色或棕褐色为阳性染色。计分方法：
6、(1)染色程度：无着色计0分，淡黄色计1分，黄色计2分，黄棕或棕褐色计3分；(2)阳性细胞百分率W5%计0分，6%〜25%计1分，26%〜50%计2分，51%〜75%计3分，276%计4分。评判标准(AXB)W1为阴性表达，>1为阳性表达。1.4统计学处理应用SPSS16.0软件学软件对数据进行处理，计量资料应JJ]Kruskal-Wallis检验，计数资料采用字2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1不同宫颈组织屮Pirn-1基因及蛋白的表达Pim-1基因在宫颈鳞癌组织中的表达水平为(1.361±0.122),明显高于正常宫颈组织的(0.023±0.002),差异
7、具有统计学意义(P〈0・05)。Pim-1蛋白在宫颈鳞癌组织中阳性表达例数为35例(76.1%),高于正常宫颈组织的3例(30.0%),差异有统计学意义(字2=6.026,P二0.014)。2.2宫颈鳞癌屮Pim-1蛋白的表达与临床特征的关系Pim-1蛋白在宫颈鳞癌组织中的表达与组织学分级、临床分期和淋巴结转移密切相关(P<0.05)o见表lo3讨论宫颈癌的发生发展是一个多因素、多步骤、多基因调控的长期过程,随着早期诊断技术不断进步如液基细胞学检测及阴道镜等［2-3］,很多宫颈癌
