微生物实验指导_下载

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1、实验一显微镜油镜的使用和细菌三种基本形态观察二、基本原理油镜是显微镜物镜中重要的镜头，其上刻有“01”或“H1”字样，也有以刻一圈红线或口线为标记，用于区别其它物镜。油镜的使用比较特殊，需在玻片与镜头Z间加滴镜油，其原理如下：1.增加照明强度汕镜的放大倍数可达100x,具镜头焦距很短，直径很小，但所需要的光照强度却最大。需在汕镜与玻片之间加入与玻璃的折射率（n二1.55）相仿的镜油（通常用香柏油,其折射率n=1.52）,目的是使进入物镜的光线不会山折射或反射造成损失，基木上全进入镜头，因此提高了照明强度，使图像更加清晰。不同介质的折射率是不同的，用空气作介质，折射率为（n=l）;

2、用水作介质，折射率为（n=1.33）,它们的折射率都比香柏油低，其光线通过玻片后会发生折射或全反射，不能完全进入物镜，造成光的损失，结果降低了视场亮度，使图像不清晰。由此可见，提高介质的折射率，就可提窩图像的清晰度。2.增加显微镜的分辨率显微镜的分辨率是指显微镜能分辨两点间最小距离（D）的能力。D值愈小则表明分辨率愈强。D值可用如下下公式表示：XD=0.61NA式中入二光波波长；NA二物镜的数值孔径值。分辨率取决于物镜的数值孔径和光源波长，即显微镜分辨率与物镜的数值孔径成正比，与光波波长成反比。波长愈短，数值孔径愈大，分辨距离愈短，则分辨能力就愈强。光学显微镜的光源不可能超出可见

3、光的波长范围（400〜770nm）,虽然利用紫外线作光源可提高分辨率，但应用范围有限,只适用于显微镜摄影而不适用直接观察。数值孔径则取决于物镜的镜口角和玻片与镜头间介质的折射率，即指介质的折射率与镜口角1/2正弦的乘积，可表示为：aNA=n.sin—2式屮n二物镜与标木间介质的折射率；a二镜口角（通过标木的光线延伸到物镜前透镜边缘所形成的夹角图1T）。图1-1物镜的镜口角影响数值孔径的因素之一是镜角口。式中a为光线最大入射角的半数。它取决于物镜的直径和焦距。当Sin（a/2）增到最大时，a/2二90°,就是说，进入透视镜的光线与光轴成90°角,这是不可能的，所以Sin（a/2）的

4、最大值总是小于1。现在所用的汕镜其a/2为60°左右。彩响数值孔径的另一因素是介质的折射率，前面已说到，不同介质的折射率是不同的，空气的折射率为1.0,水的折射率为1.33,香柏油的折射率为1.52,玻璃的折射率为1.55。因此，在物镜和玻片标本间加入香柏油作介质时，数值孔径就可以增大到1.2—1.4。人们肉眼所能感受的光波平均长度为0.55pm,假如数值孔径NA二0.65高倍物镜，能分辨两点Z间的最小距离为0.42pm,而小于0.42Pm的两点Z间距离就分辨不出,而使用数值孔径NA=1.25油镜,能分辨两点之间的最小距离=0.552X1.25二0.22pm。因为不论总放人倍数多

5、人，用普通光学显微镜是无法观察到小于0.2pm的物体。但是人部分细菌直径在0.5pm左右，故用汕镜就能清晰地观察到细菌的个体形态及某些结构。显微镜的总放人率是指物镜放人率和目镜放人率的乘积。但山于物镜和目镜搭配不同，其分辨率也不同，例如，在总放大率相同情况F，采用数值孔径大的40X物镜和10XFI镜相搭配，其分辨率就比数值孔径小的20X物镜和20X冃镜相搭配的要高些，效果也更好。三、实验器材1.标本：细菌三型玻片。2.试剂：香柏油、显微镜清洗液（酒粕乙瞇液）。3.器具：显微镜（有油镜）、擦镜纸等。四、操作步骤（用油镜观察细菌）显微镜观察时，应遵导从低倍镜到高倍镜再到汕镜的观察程序

6、，因为低倍镜视野相对人，易发现目标及确定检杳的位査。1.放置标本将染色的细菌三型玻片置于镜台上。2.找合适的视野先用低倍镜寻找合适的视野，并将欲观察的部位移到视野中央。3.转换油镜将油镜转到工作位置。1.调节聚光器与油镜数值孔径一致只要将聚光器上升到最高位置，对变光阑开到最大，此时两者的数值孔径即达到一致。2.加香柏汕取香柏汕1-2滴加到欲观察部位涂片上，从侧面注视然后将汕镜转到工作位置,下降镜筒或上升载物台，使汕镜浸入香柏汕屮。必须十分注意，油镜头不能压在玻片标本上，下降镜筒或上升载物台也不能用力过猛，否则不仅会压碎玻片，还易损坏镜头。3.调焦左眼从油镜中观察，同时转动粗调节螺

7、旋，缓慢地提升油镜调焦，至出现模糊的物彖时，再用细调节螺旋调节至物象清晰为止。如按上述操作还找不到冃的物，则口J能是由于油镜下降不到位，或因汕镜上升太快，以至眼睛捕捉不到一闪而过的物象。遇此情况，应重新操作。调焦吋，应特别注意误将粗调节器向反方向转动而损坏镜头及玻片。4.观察仔细观察细菌的三种基本形态。5.显微镜用毕后的处理上升镜筒，取F玻片，清洁油镜，先用擦镜纸擦去镜头上的香柏油,再取擦镜纸蘸取酒精乙醸液，擦去镜头上残留的油迹，然后再用干净的擦镜纸擦去残留物。最后将镜头转至“八