生物大分子的分离纯化技术

《生物大分子的分离纯化技术》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、概述蛋白质、酶和核酸等生物大分子的结构与功能的研究是探求生命奥秘的中心课题，而生物大分子结构与功能的研究，必须首先解决生物大分子的制备问题，分离不到足够纯度的生物大分子，结构与功能的研究就无从谈起。第五章生物大分子物质的制备结构与功能的研究核酸：基因序列与功能、核酶蛋白质：结构、功能、变性与折叠多糖：信息传递与免疫识别制备是基础、分析鉴定为关键生物大分子的制备有以下主要特点：⑴生物材料的组成极其复杂，含有数百种乃至几千种化合物。⑵生物大分子含量极微，分离纯化的步骤繁多，流程长。⑶许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时就极易失活，因

2、此分离过程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制备最困难之处。⑷生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难准确估计和判断。生物大分子的制备通常可按以下步骤进行：确定要制备的生物大分子的目的和要求。建立可靠的分析测定方法，这是制备生物大分子的关键。通过文献调研和预备性实验，掌握生物大分子目的产物的物理化学性质。生物材料的破碎和预处理。分离纯化方案的选择和探索，这是最困难的过程。生物大分子制备物的均一性（即纯度）的鉴定，要求达到一维电泳一条带，二维电泳一个点，或HPLC和毛细

3、管电泳都是一个峰。产物的浓缩，干燥和保存。制备生物大分子的分离纯化方法蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，主要是利用它们之间特异性的差异，如分子的大小、形状、酸碱性、溶解性、溶解度、极性、电荷和与其他分子的亲和性等。各种方法的基本原理可以归纳为两个方面：①利用混合物中几个组分分配系数的差异，把它们分配到两个或几个相中，如盐析、有机溶剂沉淀、层析和结晶等；②将混合物置于某一物相（大多数是液相）中，通过物理力场的作用，使各组分分配于不同的区域，从而达到分离的目的，如电泳、离心、超滤等。目前纯化蛋白质等生物大分子的关键技术是

4、电泳、层析和高速与超速离心。要了解的生物大分子的物理、化学性质主要有：①在水和各种有机溶剂中的溶解性。②在不同温度、pH值和各种缓冲液中生物大分子的稳定性。③固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性。④各种物理性质：如分子的大小、穿膜的能力、带电的情况、在电场中的行为、离心沉降的表现、在各种凝胶、树脂等填料中的分配系数。⑤其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性。⑥对其他生物分子的特殊亲和力。分析测定的方法主要有两类：即生物学和物理、化学的测定方法。物理、化学方法主要有：比色法、气相色谱和液相色谱法、光谱法（

5、紫外／可见、红外和荧光等分光光度法）、电泳法、以及核磁共振等。生物学的测定法主要有：酶的各种测活方法、蛋白质含量的各种测定法、免疫化学方法、放射性同位素示踪法等；实际操作中尽可能多用仪器分析方法，以使分析测定更加快速、简便。第一节材料的选择与前处理制备的一般过程和原则注意事项确立有效成分的测定方法材料的选择和预处理细胞的破碎和细胞组分分离有效成分的抽提有效成分的纯化和浓缩生物大分子分离纯化的一般步骤和原则层析法电泳法超离心法透析和超滤盐析（硫酸铵盐析）等电点沉淀有机溶剂沉淀离心│←前处理→│←粗分级→│←细分级→│材料选择与处理细胞

6、破碎（机械破碎、溶账和自溶、酶解、化学处理）生物组织→→提取液→→粗产品→→结晶分子大小溶解度电荷性质吸附性质生物亲和力依据原理注意事项基本原则：防止生物分子变性、降解1．控制适当的pH2．控制低温3．注意提取过程中的溶液环境4．防止提纯过程中丟失一些辅助因子或亚基一.选择材料及预处理动物，植物，微生物都可作为制备生物大分子的原材料，所选用的材料主要依据试验目的来确定。有效成份是指欲纯化的某种单一的生命大分子物质。而有效成分以外的其它物质则统称杂质。在动、植物和微生物材料中，有效成分的含量一般较少。如胰脏中胰岛素的含量小于其鲜重的百

7、万分之一；稳定性较差，大多数对酸、碱、高温和高浓度有机溶剂等因子较敏感；易被微生物分解变质。总的来说，材料选择应遵循的原则是，有效成分含量多、稳定性好；来源丰富、保持新鲜；提取工艺简单、有综合利用价值等。1.动物组织：选材：必须选择有效成分含量丰富且易分离的脏器组织为原材料。如磷酸单酯酶，从含量看，虽然在胰脏、肝脏和脾脏中较丰富，但是因其与磷酸二酯酶共存，进行提纯时，这两种酶很难分开。所以实践中常选用含磷酸单酯酶少，但几乎不含磷酸二酯酶的前列腺作材料。脱脂：脏器中含量较高的脂肪，容易氧化酸败，导致原料变质影响纯度操作和制品的率。常用

8、的脱脂方法有：人工剥去脏器外的脂肪组织；浸泡在脂溶性的有机溶剂（丙酮，乙醚）中脱脂；采用快速加热（50℃左右），快速冷却的方法，使溶化的油滴冷却后凝聚成油块而被除去。1.动物组织(续)：保存：对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻