生物大分子分离纯化技术1

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1、第二章生物大分子分离纯化技术1生化物质分离的特殊性：要求：分离方法简便，选择性好，效率高，保持生化物质的分子结构和构型，分离方法尽量不影响生化物质的生物活性。由于生化物质一般都很脆弱，易受化学、物理因素影响而变性，因而分离过程常要求在低温、洁净、温和的条件下进行。本章所提到的生物大分子主要是指蛋白质、酶及核酸。2生化及临床分析样品的预处理。生物样品的常规分离纯化方法，如透析、微过滤、冷冻干燥及离心技术；生物大分子的电泳分离纯化技术；生物大分子的色谱分离纯化技术；本章主要的内容包括：32.1生化分析样品的准备与预处理生化样

2、品极其复杂，首先应对所关心的待测物处于生物体的哪一个部位所获得原始的样品，并对实际分析之前应进行怎样的处理必须有所了解。42.1.1样品的类型、采集及保存样品的类型生化及临床分析的样品对象非常广泛，分布于动物或人体的每一个部位。它们可以是内源性的化合物或外源性的化合物。样品的基质可以是简单的血样、尿样，也可以是比较复杂的粪便以至整个组织。这些基质非常复杂，常常由多相组成，如血浆和血细胞及多种分子量大小不同的化合物。被分析对象的稳定性也变化极大，有只能稳定存在几分钟、对蛋白酶极为敏感的肽类，也有几乎是完全稳定的药物的代谢物

3、。5样品的采集对于给定的样品。采集处理速度与样品的代谢活性与它们的化学和生化稳定性密切相关。尿液中各种样品的浓度一般认为可稳定几小时。组织样品一般需要快速冷冻以防止发生变化，采样者应该有相应的样品采集及保存的设备。61.血样成人平均含6L的血液、其中约55％的血浆和45％的细胞。血样的采集一般采取清晨空腹采血，以避免饮食、运动、情绪等对血液成分的影响。动物一般采取禁食12～16h后采血，一般生化检验所需的血液标本采取静脉抽血。7血样有全血、血浆和血清之分。82．组织样品组织样品通常采自肝、肌肉、肺、骨髓或肠。这类组织是代

4、谢活性的，因此采样后几秒之内要在液氮中或其它冷却剂中冷冻。液氮9样品的保存一般来说，任何生物样品采集后都应立即进行分析。但由于种种原因，这往往是不可能的。样品也许需要运送到实验室，也许完成一个研究需要所有的样品同时测定。任何在法律上有效的分析必须注明保存日期及保存条件等。10生物体液中许多成分保存在室温或4℃下时，由于沉淀、蒸发、氧化或细菌的进攻等原因，其浓度会发生变化。对于血清样品，若对其中的钠或血清白蛋白进行分析，当样品保存在-20℃时，20天内不会发生明显的变化。有些成分在保存期间确实可以发生明显的变化，如儿茶酚胺

5、，因此必须保存于－20或－70℃下，必要时可以加一些抗氧化剂或酶抑制剂。让血浆或血清与红血球接触时，由于酶活性的改变成被分析对象在细胞内外分布的变化会使分析结果发生变化。所以、一般要快速分离成单一的相。11样品的初步处理尽管许多化合物在全血浆中更为稳定，但另一些，如氨基酸则应保存在不含蛋白质的溶液中。许多样品分析之前都要求除去蛋白质，用于去除蛋白质的各种沉淀方法的比较见表：12常用蛋白质沉淀方法的比较132.1.2酶样品的准备酶是一种具有催化活性的蛋白质，它的催化活性是其特征参数。任何分离纯化步骤都应考虑酶的生物活性的保

6、持问题。生理样品中酶的绝对浓度的测定从原理上讲是很简单的，分析时的主要问题是纯的酶标样的获得。14酶在天然界中总是存在于很复杂的混合物中，通常一种细胞中可能含有成百上千种酶，为了了解和分析一个复杂生理样品，如亚细胞器、细胞或整个组织中的酶，就必须将酶放在一个尽可能简单的体系中进行研究。通过对单一酶的研究可以获得酶对哪些底物具有特异性、反应的动力学参数及酶作用方式。所有这些数据对于研究酶在复杂体系中的功能是非常重要的。在许多医学及工业应用方面．是否具有纯的酶制剂非常关键。15酶活性的保持要获得生理样品酶功能研究的可靠数据必

7、须对酶进行纯化。在整个纯化过程中如何保持酶的活性是最关键的，细胞内酶在分离纯化过程中能抗各种环境对酶活性的影响。但当酶从天然的保护环境中释放出来后，它对每一步纯化步骤都很敏感，细胞膜酶对溶解尤其敏感。16可溶性蛋白质不论是存在于细胞质的还是细胞器内的，其蛋白质浓度从100mg/ml到高达400mg/ml(线粒体基质内)。体系中存在各种天然的还原剂(如谷胱甘肽)使蛋白质保持高的还原电位。其它稳定剂也存在，如不同的底物及产物。在蛋白质纯化过程中组织被破坏，蛋白质从它们的保护环境中释放出来．被限制在不同部位的蛋白水解酶也同时被

8、释放出来。所以要对所关心的酶进行保护，以防止其被氧化、水解或不可逆变性。17通过控制纯化过程中的pH、温度及有机溶剂的使用可以防止酶的变性。所使用缓冲溶液的pH应控制在6-8之间，并保持合适的离子强度使其可以防止酶变性。将纯化过程的温度降低至15-25℃可以使许多降解过程减慢3-5倍。18酶在稀溶液中由于对器皿壁或色