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1、生物大分子的分离、纯化与鉴定实验目的1.学习科学课题研究的基本程序。2.培养创新意识、独立思考、分析和综合问题的能力。启发学生查阅文献，自己设计试验方案和步骤3.正确设计从生物样品中分离纯化生物大分子的技术路线和正确实施设计方案过氧化氢酶过氧化氢酶过氧化氢酶(Catalase)是一种广泛存在于需氧动植物及微生物细胞中的氧化还原酶,结构上由4个具有相同多肽链的亚基组成,生物学功能是催化细胞内H2O2分解,防止过多H2O2对细胞的危害。现今过氧化氢酶已广泛应用于农业、纺织业、食品与乳制品业、纸浆和造纸业以及农业环保产业中,其制备的研究越
2、来越受到人们的重视。目前已有从牛肝,猪肝,动物血液、贻贝以及人胎盘等中分离纯化过氧化氢酶方法的报道,但不同程度上存在制备效率不理想、成本昂贵、技术要求高等问题。实验原理1.离子交换层析原理:固定相为离子交换剂，是利用离子交换剂对各种离子有不同的亲和力，来分离混合物中各种离子的层析技术。2.凝胶过滤层析原理:也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。3.电泳法的基本原理:电泳（electrophoresis）是指带电荷的溶质或粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的
3、现象。物质分子在正常情况下一般不带电，即所带正负电荷量相等，故不显示带电性。但是在一定的物理作用或化学反应条件下，某些物质分子会成为带电的离子（或粒子）。不同的物质，由于其带电性质、颗粒形状和大小不同，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，因此可使它们分离。实验材料与试剂1.家鸭肝脏取自健康活鸭2.试剂：0.05mol/L的磷酸缓冲液(pH=7.2)，硫酸铵，0～1mol/LNaCl，正丁醇实验仪器1.电泳仪、垂直板电泳槽。2.微量加样器3.烧杯、吸量管、滴管、微量加样器4.离心机、蠕动泵5.玻璃层析柱、螺旋夹、铁架台、
4、试管实验步骤1.粗酶液的制备：1）称取新鲜鸭肝100g,用自来水洗净,再用消毒双蒸水漂洗干净.按1:5的比例加入预冷的0.05mol/L的磷酸缓冲液(pH7.2),用高速组织捣碎机捣碎,置于4℃冰箱抽提2h;离心(6000r/min,4℃,30min),收集上清液。2）盐析法粗提过氧化氢酶:加入硫酸铵至40%饱和度,离心(6000r/min,4℃,30min)去沉淀,上清中再加硫酸铵至60%饱和度,离心收集沉淀。3）透析法纯化过氧化氢酶:将沉淀重溶于0.05mol/L的磷酸缓冲液(pH=7.2)中,4℃透析过夜,然后按1∶1的比例向
5、透析液中加入预冷的正丁醇进行脱脂,4℃静置过夜.然后6000r/min离心,弃去沉淀以及正丁醇层,重复2次,得粗酶液.2.DEAE2Sepharose离子交换层析：用磷酸缓冲液(0.05mol/L,pH=7.2)平衡至少4倍柱体积(20mL),上样5mL.用0～1mol/LNaCl溶液(含0.05mol/L,pH=7.2的磷酸缓冲液)进行梯度洗脱,流速30mL/h,每管收集5mL,紫外监测波长为280nm;测定各管过氧化氢酶活性和蛋白含量;收集活性较高的各管酶液,4℃透析过夜,冷冻干燥后进行凝胶过滤.3.SephacrylS2200
6、凝胶过滤柱层析SephacrylS2200凝胶柱按产品说明书要求处理,装柱(16mm×835mm)后,用磷酸缓冲液(0.05mol/L,pH=7.2)冲洗一定体积,上样2mL.用磷酸缓冲液(0.05mol/L,pH7.2)进行洗脱,流速18mL/h,每管收集3mL;测定每管过氧化氢酶活性和蛋白含量;收集活性较高的各管酶液,4℃透析、冷冻干燥,得到过氧化氢酶纯品.4.电泳分析分离纯化过程中,采用12%分离胶的SDS-PAGE分离蛋白,用考马斯亮兰R-250显色,观察各阶段产物的纯度变化,分析纯化效果,并鉴定纯化产物的大小。实验结果预期
7、SephacrylS2200凝胶层析测得鸭肝过氧化的全分子量为250KD,SDS2PAGE法测其多肽链分子量为6215KD,表明鸭肝过氧化氢酶由4条相同的多肽链组成.注意事项1.过氧化氢酶的最适温度与热稳定性鸭肝过氧化氢酶的最适温度为40℃左右，20～40℃具有较好的热稳定性,保温60min活性保留原有活性的90%以上.该酶60℃保温60min活性丧失50%以上,65℃保温10min活性损失殆尽。2.过氧化氢酶的最适pH与pH稳定性鸭肝过氧化氢酶在pH710左右时活性最强,pH510～715活力较高,超出其范围活力较低。鸭肝过氧化氢
8、酶在pH3～8的范围内是比较稳定的,在pH5～8的范围内活性基本保留原有活性的90%以上,pH910时,残余酶活力不到60%谢谢！
