实验七细胞骨架的观察(考马斯亮兰R250染植物细胞的微丝).jsp

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1、实验七细胞骨架的观察考马斯亮兰R250染植物细胞的微丝一、实验目的掌握观察植物细胞内微丝的方法。了解观察动物细胞内微丝的方法。二、实验原理细胞骨架是指细胞质中纵横交错的纤维网格结构，安组成成分和形态结构的不同可分为微管、微丝和中间纤维。它们对细胞形态的维持、细胞的生长、运动、分裂、分化和物质运输等起重要作用。光学显微镜下细胞骨架的形态学观察多用1％TritonX-100处理细胞，可使细胞膜溶解，而细胞骨架系统的蛋白质被保存，再用考马斯亮兰R250染色，使得细胞质中细胞骨架得以清晰可见。细胞骨架微管微

2、丝中等纤维三、材料和试剂材料：新鲜洋葱鳞茎器材：光学显微镜、天平、吸管、载玻片、盖玻片、烧杯、镊子、剪刀、表面皿、染色缸试剂：0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.8），1％TritonX-100（用M-缓冲液配制），M-缓冲液，3%戊二醛（用0.2mol/L磷酸盐缓冲液配制），0.2％考马斯亮兰R250M-缓冲液咪唑KClMgCl2·6H2OEGTA（乙二醇双（α-氨基乙基）醚四乙酸）EDTA（乙二胺四乙酸）巯基乙醇甘油（丙三醇）蒸馏水四、实验步骤1.取洋葱近中轴鳞片内表皮和靠近外层的鳞茎内表皮作

3、对照，大小1㎝2，放入盛有0.2mol/L磷酸盐缓冲液[PBS]（pH6.8）的青霉素瓶中；2.吸去缓冲液，加入1％TritonX-100处理洋葱内表皮20-30min；3.吸TritonX-100，用M-缓冲液充分清洗3次，每次3min；4.用3%戊二醛固定20min；5.用[PBS]清洗3次，每次10min；6.0.2％考马斯亮兰R250染色20-30min；7.用蒸馏水清洗1-2次；8.压片，镜检。结果微丝束呈深蓝色TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)作用：非离子去垢剂适当浓度的Tri

4、tonX-100，破坏膜结构、可使细胞膜溶解，而细胞质中的细胞骨架系统可被保存；M－缓冲液和磷酸缓冲液作用:清洗组织细胞、稳定骨架蛋白，维持细胞的渗透压；EDTA（乙二胺四乙酸）和EGTA（乙二醇双醚四乙酸）作用：前者可螯合大部分金属离子；后者专一性螯合Ca2＋，主要是高浓度的Ca2＋可是微管解聚，因此加入EGTA来降低Ca2＋的浓度；戊二醛作用：良好的固定剂，使细胞结构保持它原有状态；考马斯亮兰作用：非专一性结合蛋白质，使蛋白着色（蓝色）。实验的关键：TritonX-100抽提处理的时间很关键，如

5、果处理时间太短，没有抽提掉细胞器膜上的蛋白，会造成很深的背景颜色，干扰细胞骨架的观察；如果处理时间太长，会破坏骨架蛋白使骨架纤维断裂。五、实验结果洋葱内表皮细胞骨架的考马斯亮兰染色结果洋葱鳞茎外层与内层的内表皮细胞比较（放大倍数10×20）左：鳞茎外层（对照）；右鳞茎内层四、实验方法与步骤（一）实验准备试剂的配制；实验材料的预处理；实验方法的设计。改变TritonX-100的浓度和作用时间温度、pH值、金属离子对细胞骨架的影响探究内容：