单克隆培养法分离、鉴定人神经胶质细胞瘤细胞株u251干细胞论文

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1、单克隆培养法分离、鉴定人神经胶质细胞瘤细胞株U251干细胞硕士研究生:刘霄导师：林宁教授中文摘要目的研究人神经胶质细胞瘤细胞株U251中肿瘤干细胞的分离、培养及鉴定方法。方法将贴壁生长的U251细胞用胰酶消化成单细胞悬液，1200rpm/min离心5min后加入含有EGF、bFGF、N2、B27、L-glu及青链霉素的DMEM/F12培养基重悬细胞，以大于10“孔接种到24孔培养板中，以后逐日观测肿瘤球生长情况，待肿瘤球形成并从板底脱落后，将肿瘤球吸出离心反复吹打至单细胞悬液，以每孔1・2个细胞转移至96孔板中行单克隆培养，

2、以后动态记录形成次代肿瘤球的孔，同样方法进行培养三代肿瘤球。添加含血清的培养基行肿瘤球分化前后光镜、电镜形态以及细胞免疫荧光染色研究。结杲贴壁生长U251细胞在含各种因了及添加剂的无血清培养基中经7天左右可以形成形状较为规则的肿瘤球，单克隆培养三代肿瘤球所需时间明显缩短至约48小吋。添加含血清培养基后三代肿瘤球可以明显分化，行免疫荧光染色肿瘤球可以表达Ncstin干细胞标记物，分化后细胞可表达星型胶质细胞GFAP、神经元P-TubulinIII等标记物。单克隆培养形成的肿瘤球细胞分化前后的电镜形态存在明显差异。结论在建系已久

3、的人脑胶质瘤细胞系U251屮分离肿瘤干细胞可以避免原代培养肿瘤干细胞屮混杂其他细胞的缺陷，单-克隆培养出来的肿瘤干细胞形状更为规则、细胞种类更为单一。单克隆培养法不失为一种简便、有效分离干细胞的方法。U251肿瘤球保持了干细胞球的特性，自我更新、多向分化潜能以及分化前后表达不同的标记物。本实验进一步证实了脑肿瘤细胞系中存在脑肿瘤干•细胞亚群，为脑肿瘤干细胞基础研究建立研究平台，从而进一步为临床治疗脑肿瘤提供理论依据。关键词肿瘤干细胞；脑肿瘤；U251IsolationandCharacterizationofCanceSte

4、mCellsfromaHumanGlioblastomaCellLineU251Postgraduate:LiuXiaoTutor:Prof.LinNingAbstractObjective:TostudythemethodofisolationandidentificationofthecancerstemcellsfromhumanglioblastomacelllineU251.Methods:TheadherencegrowingU251glioblastomacellsweredigestedintosinglec

5、ellsuspensionwithtrypsin.Thenre-suspendedcellstosinglecellsuspensionafter5mincentrifugation1200rpm/minwithDMEM/F12mediumcontainingEGF,bFGF,N2,B27,L-glu,penicillinandstreptomycin・Thecellswereseededin24-wellplatesatmorethanlOscells/well.Observethewellseverydaytillsom

6、etumorcellspherescouldbeseefelloffthebottomoftheplate.Thesphereswereblewrepeatedlytosinglecellssuspensionandthenwereseededin96-wellplatesat1-2cell/well.Thenmarkthewellswhichformedsecondgenerationtumorspheresdynamically.Usethesamewaytoculturethethirdgenerationtumors

7、pheres・Thenstudythemorphologyofthetumorspheresunderlightandelectronmicroscopeandimmunofluorescencestainingbeforeandafterdifferentiationwithserum-containingmedium0Results:TheadherencegrowingU251cellsformedrulestumorspheresculturedinserum-freestemcellmediumafterabout

8、7days,thetimeofformingthirdgenerationtumorspheresthroughmonoclonalexperimentsignificantlyreducedtoabout48hours.Thethirdgenerationtumorspherescoul