lislin自杀基因真核表达载体的构建及pegfp审审n1审审lis对肝癌细胞hepg2中的表达鉴定

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1、第叨军医大学硕士学住怡丈缩略语表缩略词英文全称中文全称AFPalphafetoprotein甲胎蛋白bpbasepairs碱基对BSAbovinserumalbumin牛血清白蛋白cDNAcomplementaryDNA互补脱氧核糖核酸DNAdeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸FBSfetalbovineserum小牛血清mRNAmessengerRNA信使RNAPCRpolymerasechainreaction聚合酶链式反应ncchepatocellularcarcinomei肝癌EBEthidiumbromi

2、de澳化乙锭KanKanamycin卡那霉素kbKilobasepairs千碱基对EGFPEnhancedgreenfluorescentprotein增强型绿色荧光蛋白TrisTrishydroxymethylarninomethane三轻甲基氨基甲烷LisLinamarase亚麻苦貳水解酶LinLinamarin亚麻苦貳PBSPhosphate—bufferedsaline磷酸盐缓冲液5-FC5-flourocytosine5■氟胞囉唳5-FU5・fluorourikine5—氟尿卩密噪GCVganciclovir丙氧鸟昔CD

3、E.coli-cytosinedeaminase大肠杆菌胞卩密噪脱胺酶BEbystandereffect旁观者效应RNaseribonucleaseRNA酶EDTAThylenediaminetetra-aceticacid乙二胺四乙酸纯疱疹病毒胸腺卩密噪HSV-TKHerpessimplexvirus-thymidinekinase核营氨酸十二烷基SDS-PAGESodiumdodecylsulphate・polyacrylamidegelelectrophoresis磺酸钠一聚丙稀酰胺凝胶电泳一2_lis/lin自杀基因真核表

4、达载体的构建及pEGFP-Nl-lis对肝癌细胞HepG2中的表达鉴定硕士研究生：马俊导师：窦科峰教授辅导教师：李海民副教授—第四军医大学西京医院肝胆外科，西安710032中文摘要基因治疗是现代医学研究的热点问题，以肝为靶点的基因治疗更是倍受关注。近年来，肝靶向性基因治疗取得了很大的进展。肝细胞是基因定向转导的理想靶部位，因为肝脏是少数几个实质细胞和血液直接相通的器言之一。目前对原发性肝癌(primarylivercarcinoma)多主张采用手术联合放化疗的综合治疗为主，其五年生存率一般在5%左右，其疗效仍然不能令人满意。因此，

5、探讨新的治疗方法具有极其重要的意义。近年来肿瘤的基因治疗发展迅速，主要的方法有自杀基因、免疫基因、多药耐药基因以及抗血管生成基因等。其中自杀基因被认为是最有前景的基因治疗方法之一。自杀基因治疗(Suicidegenetherapy)乂称酶/药物体前体疗法(enzyme—prodrugtherapy,EPT),是利用转基因技术将哺乳动物中所不含有的自杀基因转入到哺乳动物肿瘤细胞中，该基因表达的产物可将无毒性的药物前体转化为毒性药物，从而选择性的杀伤肿瘤细胞，常用的自杀基因有单纯疱疹病毒胸腺卩密噪核甘酸激酶(herpessimplex

6、virus第四军医大学硕士学住论丈—thymidinekinase,HSV—TK)基因和大肠杆菌胞U密噪脱氨酶(E.coli—cytosinedeaminase,CD)基因。已有的研究证实联合基因治疗具有单一自杀基因无可比拟的优越性，越來越受人们关注。冃的：本研究旨在构建真核表达质粒pEGFP-Nl-lis,并电穿孔转染IIepG2细胞，以寻求有效的自杀基因治疗方法。方法:通过增强型绿色荧光蛋白(EGFP)与linamarase融合蛋白真核表达载体构建和表达，为1inamarase用于肝癌基因治疗提供科学的实验依据。方法：首先根据

7、linamarase的DNA序列分别设计、合成引物，应用Rt-PCR法扩增linamarase基因，序列测定分析，并将扩增后产物插入克隆载体pEGFP-Nl中，获得重组质粒pEGFP-Nl-lis并进行菌落鉴定及重组质粒的酶切分析。然后以电穿孔方法将重组表达质粒pEGFP-Nl-lis转染HepG2细胞，新霉素(GeneticinG418)筛选后获得稳定表达的HepG2-lis细胞，并经RT-PCR鉴定lis是否整合到HepG2细胞DNA链中并转录表达，应用Westomblot检测相关蛋白的表达。结果:成功克隆了木薯linamar

8、ase基因，并进行了DNA序列分析和基因库报道的基因序列基本一致，然后将克隆的linamarase基因插入克隆载体pEGFP-N1，成功构建了重组表达质粒pEGFP-Nl-lis,并分别进行了菌落分析和酶切鉴定。将重组质粒pEGFP-Nl-lis成