产抗霉菌活性产物的拮抗菌的分离、筛选及初步鉴定

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1、产抗霉菌活性产物的拮抗菌的分离、筛选及初步鉴定产抗霉菌活性产物的拮抗菌的分离、筛选及初步鉴定【摘要】从白菜、龙眼、香蕉三种不同种植物土壤屮分离筛选出能抑制霉菌生长繁殖的拮抗菌，采用五点采样法从以上三种不同植物种植地采集土壤，制备土壤菌悬液，通过分离和筛选，选出对霍菌有抑制作用的菌株，分别进行固体和液体培养，检验该菌株及其代谢产物对青霉菌是否都有抑制作用，并采用湿重法测沱不同pH值情况下的生长量。在完成第二次纯化后发现并没有分离出拮抗菌，原因可能为实验仪器的原因、操作不规范和人为等因索。【关键词】霉菌拮抗菌分离和筛选纯化前

2、言：新鲜的水果在采摘、运销、以及贮藏过程中因病害腐烂而导致巨大的经济损失。水果采后贮运防腐是水果生产健康发展屮必不可少的重耍环节。数十年来,国内外普遍使用化学防腐剂、化学杀菌剂处理进行贮、运防腐。化学防腐剂、化学杀菌剂用于农业病虫害防治及防腐已有悠久的历史，在具有众多优点的同时,也给人类带来了新的问题因此迫切需要寻找一种有效而对人类无害的防治方法。以微生物的提取物用于水果采后防腐保鲜己显示出巨大的应用前景，并成为一个新的研究热点。天然防腐保鲜剂取代化学杀菌剂进行水果采后病害的防治，对减少食品屮农药的残留、保护环境、保证食

3、品安全等具有重要意义。微生物的代谢产物是源于天然的物质，容易被分解，杀菌活性物质用于水果的采后防腐不会造成累积慢性屮毒，亦不会造成果品与环境污染，开发适用于水果采后贮藏防腐的微生物杀菌活性物质不仅符合当今社会发展的需要，而门•产品具有极大的国内外市场需求量。随着科技的不断进步和人类环保意识的增强，生物防治菌及生物抑菌活性物质、生物防腐剂的研究和开发己越来越受到人们的重视,并逐渐被认为是解决上述问题的一种有效的途径。拮抗微生物是生长中能产生对其它微生物具杀死与生长具有抑制作用的生物活性物质微生物。土壤是微生物生长发育的良好

4、环境，生防菌的主要來源是土壤，故本实验从土壤中分离筛选抑制青霉菌繁殖生长的拮抗菌，提高获得拮抗菌的成功率。1材料与方法1.1采集土样1.11采集时间：2012年4月22日1.12采集地点:城东镇石下村石岭1・13采集方法：从白菜、龙眼、香蕉等植物土5-20cm内的土壤取土样，每块地取5个点，每点取土约100g,共500g土混装在起。取土时记录釆样时间、地点、地面植物种类。将采集來的土样晾干2-3天，备用。1.14采集图片图1采集地点图2龙眼树种植地图3白菜种植地图4香蕉树种植地1・2接抗菌的分离1・21准备工作1.211

5、制备培养基高氏一号培养基：可溶性淀粉20g,氯化钠0.5g,七水硫酸亚铁O.Olg,七水硫酸镁0.5g,硝酸钾1g,磷酸氢二钾0.5g,琼脂15g,蒸绸水1000ml,pH7.4~7・6(121°C,20min)o马铃萼衙萄糖琼脂培养基(PDA):马铃苕200g,甸萄糖20g,琼脂15g,自来水1000ml,自然pH(121°C,20min)o牛肉膏蛋白月东固体培养基：牛肉膏3g,蛋白月东10g,氯化钠5g,琼脂15g,自来水1000ml,pH7・2~7.4(121°C,20min)o发酵培养基：培养基酶解玉米淀粉30g

6、、大豆饼粉20g、酵母膏lg,加适量a-淀粉?W80°C水浴30mino1.212无菌水及器皿制备无菌水、空试管与三角瓶（塞上棉塞）灭菌、刻度吸管包报纸后灭菌。1.3土壤浸提液制备把采集来的土样除去大颗粒、植物残体，充分混匀，称10g土放入250三角瓶中，加入90ml无菌水，塞上棉塞，浸泡、搅拌30mino静置lOmin,再10倍稀释法稀释至101.4土样微生物的分离1.41PDA+病原菌平板制备将病原菌制成抱子悬浮液，取他子悬浮液lml加入到无菌培养皿内。将融化的PDA培养基冷却至45°C到入已加病原菌悬浮液的培养皿

7、内（每培养皿内加培养基15ml）,振荡使病原菌抱子均匀与培养基混合，冷凝后备用。1.42拮抗放线菌的分离、筛选在高氏一号培养基平板内加入土壤浸提液0.5ml,用无菌曲玻棒均匀展布于整个平板表而，28°C培养观察，每个样至少做4个平板。挑取单菌落放于含病原菌的PDA平板，每平板可均匀接5-10个左右放线菌单菌落菌丝体，28°C培养观察，将产牛透明抑菌圈的放线菌菌丝体接种到斜面，产生他子后，制备抱子悬浮液再平板纯化。纯化时挑单菌落于斜面得纯培养，进行菌株编号，斜而菌种再进行平板抑菌试验，保存产生抑菌圈的菌株（低温）。获得的抑

8、菌圈犬的拮抗菌株用三角瓶液体振荡培养，培养基酶解玉米淀粉30g/L、大豆饼粉2530g/L、酵母膏230g/L,250ml三角瓶内装50ml培养基，28°C、200r/m振荡培养4-5天，每个斜面应做3个重复。収培养液5000-9000r/m离心20min,取清液，将无菌的6mm直径滤纸片2张在清液内浸30s,取出放