HK基因的选择和性质

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1、*1HK基因的选择和性质许秀竹2010.1.20*2一、HKG的选择（一）实时反转录PCR（RT-PCR）技术介绍：因为它的灵敏性，特异性和对于选择基因的高通量和准确的表达谱的广泛量化范围，实时反转录PCR（RT-PCR）测量转录丰度已经变成一种常用方法。RT-PCR是对于小基因集合的微阵列数据的确认和分子诊断最普遍使用的方法，并且当细胞数量很少时是特别有用的。RT-PCR技术存在的主要问题是不合适的数据标准化。各种策略已经被用来控制基因表达的结果。当只有很少数量的RNA可用时，全部RNA的*3量化是困难的。而且，它只能测量全部RNA的一小部分样本。所以，HKG是标准化

2、mRNA分数的金标准。然而，通常使用的HKG的基因表达有相当大的变化，这将增加实验的噪声，并且可能最终导致错误的结果。为了检测最稳定表达的HKG，我们使用来自13629个公开的人类基因组大的表达数据集合，并且整合基因表达水平的丰度和稳定性。并且用2543个老鼠样本证实了人类的结果。数据处理：1.从公开数据库中下载13629个可用样本的微阵列表达数据，这些数据来自两个平台。这个样本集合包含各种不同组织和不同实验条件的基因表达数据。2.两个平台都可用的探针集合转化成官方的基因名，如果多个探针对应同一个基因取平均表达值。3.用quantilenormalization处理数据

3、，然后再用log2转化表达值。*4*5结果和讨论：一个候选的HKG定义为：最稳定表达的基因，即一个基因有很小的变化系数（CV）和最高倍的变化<2(MFC，在数据集中观察到最大值和最小值的比率)。另外，平均表达水平低于最大表达水平减去2的偏差是该候选基因的一个先决条件。*6在13629个不同的样本集合中13037个唯一的基因的表达水平被使用。表一显示了检测到的前15个候选HKG。所有的15个基因CV值低于4%,并且方差低于0.49.而且，MFCs的范围在1.41（RPL27）1.99(RPS12)之间，反映出在大的数据集中这些候选HKG表达的很小的差异。这15个基因中的1

4、3个编码了参与蛋白质合成的核糖体蛋白。表达水平的分布如：图1a*7下面研究通常使用的HKG的表达水平（如：ACTB,GAPDH,HPRT1,B2M）。这些通常使用的HKG的表达水平波动很大。(表二)*8MFC的范围在1.91（ACTB）到15.15（ALDOA）之间。然而12个通常使用的HKG中只有一个（ACTB）基因的CV值低于5%，反映了在大的数据集中通常使用的HKG有很大的变化水平。值得注意的是：常用的HKG没有一个排在检测到的候选HKG的前50位。通常使用的HKG的表达水平分布是：图1b*9为了证明这些新的候选HKG使用的可行性，我们建立5个前15个候选HKG的

5、引物（如：RPL27,RPL30,OAZ1,RPL22,RPS29）我们用PCR检测理想产物的长度和特异性，无假基因扩增。（图二）*10为了验证检测到的新的候选HKG更加稳定，我们使用另一种哺乳动物的模型系统（老鼠）。使用2543个不同老鼠样本集合中的21377个唯一的基因的表达水平。人类数据集中检测到的新的候选HKG在老鼠的实验中也显示出稳定性。（表三）。而且，在老鼠的试验中，编码核糖体蛋白的基因也是最稳定表达的。因此，检测到的候选HKG表达的稳定性在另一个物种中也得到了验证。*11（二）结论：1.新的候选HKG比经常使用的HKG在不同的细胞和实验条件下更加稳定的表达

6、。2.以处处且稳定表达的定义为基础，结果表明没有一个单个基因有资格称为“真正的”HKG。3.在90%以上的情况中，GAPDH和ACTB可以作为单个控制基因。4.在许多年中，通常使用的控制基因在质变的测量技术中认为是很好的参考，因为这些基因在几乎所有的基因中高水平表达。然而，RT-PCR出现放置重点在量变上，并且要求对这些HKG重新评估。*125.检测到的新的候选HKG在功能方面没有很大的变化，他们主要是参与蛋白质合成的核糖体蛋白质。因此，这可能为研究这些特定细胞过程的实验者将更好的使用我们分析得到的其他候选HKG。6.使用荟萃分析，我们可能找到，在不同组织类型和实验条件

7、下，比通常使用的HKG变化水平低的候选HKG。检测到的新的候选HKG可以没有任何限制的用在以后的几乎所有的RT-PCR实验中。*13二、用于RT-PCR标准化的HKG的选择(一)引言：实时RT-PCR是目前低丰度mRNAs检测最灵敏的方法，并且有不同的应用，如：临床诊断，TSG表达分析，和植物研究。为了避免偏差，RT-PCR需要参照一个内部控制基因。理想的情况是，实验条件不应该影响这个内部控制基因的表达。然而，许多研究显示：内部标准（用于mRNA表达量化的主要是HKG）可能随实验条件变化。根据已有结论，内部标准应该至少有两个或者三个HKG