暹罗鳄鱼鳞酶解物改善小鼠免疫力探究

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1、暹罗鳄鱼鳞酶解物改善小鼠免疫力探究【摘要】本实验主要研究暹罗鳄鱼鳞酶解物对小鼠免疫力的影响。采用10、20、40mg/kgbw给小鼠经口灌胃30d,分别进行小鼠抗体生成细胞检测（Jerne改良玻片法血清溶血素的测定（血凝法X碳廓清实验。结果发现：鳄鱼鳞酶解物各剂量组的抗体生成细胞数量明显高于阴性对照组，高剂量组与对照组有显著的差异（分别为p<0.05）;W解物各剂量组的抗体积数均高于对照组，高剂量有显著差异（P<0.05）;中、高剂量组均能增强小鼠碳廓清能力，高剂量组与对照组相比有显著性差异（P<0.05'结论：暹罗鳄鱼鳞酶解

2、物能提高小鼠免疫力。【关键词】暹罗鳄；鱼鳞；酶解物；免疫力【中国分类号】R267【文献标识码】A【文章编号】1044-5511(2011)11-0125-01随着鳄鱼人工养殖的成功，其价值得到多方面的开发,包括旅游观赏、餐饮、时装皮具等等。鳄鱼皮主要用于制作高档皮具，鱼鳞却成了工业垃圾。如何提取、利用鱼鳞的胶原蛋白将会成为水产综合开发的新突破。胶原蛋白的生物活性主要体现在提高免疫活性、降血压、调血脂、抗氧化、活化细胞机能和抑制肿瘤活性等方面[1]o津田友香等从鱼皮中得到水解胶原三肽，并证明具有促进人皮肤成纤维细胞胶原和透明质酸的

3、生成、改善皮肤弹性的作用［2］oKoyama等发现胶原蛋白多肽能提高皮肤真皮和表皮的功能［3在美国、德国、日本等国家，许多高档化妆品中添加有胶原蛋白。美国CTFA化妆品原料手册录用的天然物质和《功能性化妆品原料》中，都有胶原蛋白或其水解产物［4〜5Jo文献报道中多为各种鱼鳞胶原蛋白的免疫增强作用，未见鳄鱼鳞胶原蛋白的相关研究。因此，本实验以小鼠为研究对象，探讨暹罗鳄鱼鳞胶原蛋白多肽对正常小鼠免疫功能的影响，为产品开发提供依据。1材料和方法［6］1.1材料与试剂:暹罗鳄鱼鳞酶解物：鳄鱼皮购自大丰实业(三亚)有限公司养殖场，酶解物自

4、制。1.2制法：用热水烫鳄鱼皮，使鱼鳞自皮上脱落，得到鱼AX鳞，鱼鳞剪成小块，加0.05mol/L-1NaOH溶液(W:V=l:6)浸泡1h,水洗至中性。再加0.2%硫酸溶液(W:V=l:6)浸泡1h,洗至中性，最后用热水抽提过夜，4000r/min-1离心20min，弃去沉淀不溶物，得到粗胶制品，浓缩后,45°C低温蒸干。称取制备的胶原蛋白，用缓冲液(pH9.0,0.02mol/L-1)100ml溶解制成I%的胶原溶液。以酶与底物比为I:20的比例加中性蛋白酶，在459水浴中水解5h后，沸水浴中灭活酶15min,4000r/m

5、in-1离心I5mino取上清液，即为鳄鱼鳞胶原蛋白酶解液，-209保存备用。清洁级BALB/C小鼠，雄性，18〜22g,购自北京大学实验动物研究中心。脱毛剂、绵羊红细胞(SRBC,Hank's液(pH7・2~7・4)、生理盐水、琼脂糖、SA缓冲液、印度墨汁、Na2CO3等。1.3仪器与设备:电子天平、微量血凝试验板、离心机、5%CO2培养箱、200目筛网、载玻片、保温箱、721型分光光度计等。1.4动物实验分组与剂量设定:小鼠，18-22g,随机分为4个组每组12只，分别为鳄鱼鳞酶解物10.20.40mg/kg组和阴性对照组，

6、灌胃30d，阴性对照给予体积为0.2ml/10g生理盐水。1.5动物实验检测(1)抗体生成细胞检测(Jerne改良玻片法)：取脱纤维的羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心10mir<2000r/min)用生理盐水将压积SRBC配成2%(v/v)的细胞悬液，每鼠腹腔注射0.2ml。将免疫后5天的小鼠处死,取脾脏置盛有HanKs液的平皿内，轻轻磨碎脾脏，制成细胞悬液，经200目筛网过滤，离心10min(2000r/min),用Hank's液洗涤2遍，最后将细胞悬液浮在8mLHank's液中。将表层培养基(1g琼脂糖加双蒸水至100mL

7、)加热溶解后，放45~509水浴保温，与等量Ph7.2~7.4、2倍浓度的Hank's液混合，分装小试管，每管0.5ml,再向管内加入50pL10%SRBC(v/v,用SA缓冲液配制、25pL脾细胞悬液，迅速混匀后倾倒于已刷琼脂糖层的玻片上，做平行片,待琼脂凝固后，将玻片平扣在玻片架上，放入二氧化碳培养箱中孵育1・5h，用SA缓冲液稀释的补体(1:8)加入玻片架凹槽内，继续孵育1.5h,计数溶血空斑数。用空斑数/全脾细胞表示抗体生成细胞数。(2)血清溶血素的测定(血凝法):取脱纤维的羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心10min(

8、2000r/min),用生理盐水将压积SRBC配成2%(v/v)的细胞悬液，每鼠腹腔注射0.2ml。将免疫5天后，摘除小鼠的眼球取血于离心管内放置约1h2000r/min离心10min,分离、收集血清。用生理盐水将血清倍比稀释，将不同稀释度的血清分别置于微量血凝