DB21∕T 2465-2015 新城疫强弱毒株R∕T-PCR鉴别诊断技术

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1、ICS11.220B41DB21辽宁省地方标准DB21/T2465—2015新城疫强弱毒株RT-PCR鉴别诊断技术MethodofRT-PCRthatDistinguishesLentogenStrainsFromVirulentStrainsof-NewcastleDiseaseVirus2015-04-30发布2015-06-30实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/T2465—2015前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由辽宁省动物疫病预防控制中心提出。本标准由辽宁省畜牧兽医局归口。本标准

2、由辽宁省质量技术监督局发布。本标准起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省动物医学研究院。本标准主要起草人：吴运谱、顾贵波、石霖、薛树山、杨作丰、王宏燕、马建山、闫海滨、何欣、王志国、张爽IDB21/T2465—2015新城疫强弱毒株RT-PCR鉴别诊断技术1范围本标准规定了新城疫强毒株、弱毒株的TaqMan实时荧光RT-PCR检测方法。本标准适用于禽类棉拭子样品、组织样品及相关样品的尿囊液的新城疫病毒强、弱毒株的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用

3、于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。中华人民共和国农业部公告第302号兽医实验室生物安全技术管理规范3缩略语下列缩略语适用于本标准。NDV：新城疫病毒DEPC：焦炭酸二乙酯PBS：磷酸盐缓冲生理盐水BSA：牛血清白蛋白RNA：核糖核酸BP：碱基对RT-PCR：反转录聚合酶链式反应Taq酶：TaqDNA聚合酶Ct值：每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数4原理通过对大量强毒株和弱毒株的序列比对分析，设计其相应的引物及其探针。探针5′端标记FAM荧光素为报告荧光基团

4、（用R表示），3′端标记MGB荧光素为淬灭荧光基团（用Q表示），其在近距离内能吸收5′端荧光基团发出的荧光信号。PCR反应进入退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上R基团发出的荧光信号被Q基团所吸收，仪器检测不到荧光信号；而反应进行到延伸阶段时，Taq酶的5′→3′的外切核酸酶功能将探针降解。这样探针上的R基团游离出来，所发出的荧光不再为Q所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环进行，PCR产物与荧光信号的增长呈现对应关系。5仪器与器材1DB21/T2465—2015高速台式冷冻离心机（最大离心力

5、12000g以上）、冰箱（2～8℃，-20℃和-70℃三种）、荧光PCR扩增仪、分析天平、1.5mL离心管、0.5mLPCR反应管、微量移液器和吸头（1000μL、100μL和10μL三种）。6试剂与材料6.1Trizol：RNA抽提试剂，外观为粉红色，分装至棕色瓶中，于4～8℃保存。6.2氯仿：4℃预冷。6.3异丙醇：4℃预冷。6.475%乙醇：用无水乙醇和DEPC水配制，-20℃预冷。6.5DEPC水：去离子水中加入0.1%DEPC，37℃作用1h，121±2℃，高压灭菌15min。6.6RNA酶抑制剂（40U/μ

6、L）。6.7DNA聚合酶：HSTaqDNA聚合酶（5U/μL）。6.8dNTP(2.5mmol/L)。6.9反转录酶：AMV反转录酶（5U/μL）。6.10阴性对照：DEPC水。6.11阳性对照：疫苗株（Clone30株）、标准强毒株F48E9。6.12PBS：磷酸盐缓冲液（0.02mol/LpH7.2）。6.13引物：用于RT-PCR反应的引物浓度为10μmol/L，鉴别引物及其探针见下表1。表1鸡新城疫强、弱毒株鉴别诊断RT-PCR引物及其探针毒株类型引物及探针名称引物及探针序列(5′-3′)位置(BP)扩增片段长

7、度探针修饰方式弱毒株LF3TCCGBAGGATACAAGAGTCYGTGACC4839–486485bp探针Lprobe2为5′LF4TCCGBAGGATACAAGAGTCYGTGACTFAM标记，3′端MGBLR2AGAGCYACACCGCCAATAAT4923–4904标记LR3AGAGCYACACCACCGATAATLprobe2CAGGGRCGCCTTATA4883–4897强毒株VF1GAYTCYATCCGYAGGATACAAGRGTC4832–485799bp探针Vprobe1、/中强毒株VR2AACCCC

8、AAGAGCTACACYRCC4930–4910Vprobe2均为5′FAMVR3GACCCCAAGAGCTACACYRCC标记，3′端MGB标记Vprobe1AARCGTYTCTGYCTCC4893–4878Vprobe2AGARACGCTTTRTAGGTGC4884–4902注：B=C,G或T；Y=T或C；R=G或A7操作步骤