DB21∕T 2469-2015 H1N1亚型猪流感病毒荧光R∕T-PCR检测方法

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1、ICS11.220B41DB21辽宁省地方标准DB21/T2469—2015H1N1亚型猪流感病毒荧光RT-PCR检测方法MethodoffluorescentRT-PCRforthedetectionofH1N1swineinfluenzavirus2015-04-30发布2015-06-30实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/T2469—2015前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由辽宁省动物疫病预防控制中心提出。本标准由辽宁省畜牧兽医局归口。本标准起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省动物医学研

2、究院。本标准主要起草人：关淼、曹东、兰德松、魏澍、赵凤菊、陈瑶、姚伟、刘坤洋、张雷、杨国丽、魏园园IDB21/T2469—2015H1N1亚型猪流感病毒荧光RT-PCR检测方法1范围本标准规定了H1N1亚型猪流感病毒（swineinfluenzavirus，SIV）荧光RT-PCR检测方法的范围、器材和试剂、引物和探针、操作步骤、结果判定和废弃物处理。本标准适用于H1N1亚型猪流感的诊断、监测以及流行病学调查，适用于猪鼻咽棉拭子、肺脏及肺脏淋巴结、鸡胚尿囊培养液以及细胞培养物中H1N1亚型SIVHA和NA基因的检测。本标准中的试验操

3、作应在生物安全Ⅱ级（BSL-2）以上的实验室进行。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。兽医实验室生物安全技术管理规范病原微生物实验室生物安全环境管理办法GB/T27521-2011猪流感病毒核酸RT-PCR检测方法GB/T27536-2011猪流感病毒分离与鉴定方法3缩略语本标准涉及下述缩略语。SIV：猪流感病毒（swineinfluenzavirus）荧光RT-PCR：荧光反转录聚合酶链式反应（

4、realtimefluozescentquantitativereversetranscriptionpolymerasechainreaction）PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）RNA：核糖核酸（ribonucleicacid）DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）cDNA：互补脱氧核糖核酸（complementaryDNA）HA：血凝素（Hemagglutinin）NA：神经氨酸酶（Neuraminidase）PBS：磷酸缓冲液（配方见附录A）（phosphat

5、ebuffersolution）DEPC：焦炭酸二乙酯（diethylpyrocarbonate）4原理SIV是一种RNA病毒。RNA反转录产生的cDNA可作为PCR模板进行扩增。根据H1N1亚型SIV保守基因序列设计一对特异性引物以及一个TaqMan探针，在酶催化下，以母链DNA为模板，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA。Taqman探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光集团和一个淬灭荧光集团。1DB21/T2469—2015在PCR扩增时，探针被酶切降解，使报告荧光集团和淬灭荧光集团分离，就形成可被仪器接受的荧光信号

6、。5器材和试剂5.1器材高速台式冷冻离心机（最高转数12000r/min以上）；冰箱（2～8℃，-20℃和-70℃三种）；混合器；荧光PCR扩增仪；微量移液器；病毒采集管；PCR八联排管或96孔板；吸头（10μL，200μL，1000μL）；无菌注射器；1.5mL离心管、15mL离心管经121（±2）℃高压灭菌15min；研钵或组织匀浆器、眼科剪、眼科镊、剪刀、镊子经160℃干热灭菌2h。5.2试剂PBS：121（±2）℃高压灭菌15min，冷却后，无菌条件下分别加入10000U/mL青霉素、链霉素。Trizol：RNA抽提试剂，外

7、观为粉红色，4～8℃保存。氯仿：4℃预冷。异丙醇：4℃预冷。75%乙醇：用新开封的无水乙醇和DEPC水配制，-20℃保存。DEPC水：1mLDEPC溶于1L去离子水配制成0.1%DEPC水，37℃作用1h，然后121（±2）℃，高压灭菌15min，避光，于密闭容器中2～8℃保存。RNA酶抑制剂（40U/μL）。DNA聚合酶：ExTaqHS（5U/μL）。6引物和探针用于RT-PCR反应的引物浓度为20μmol/L，其序列如下：H1HA基因引物：上游引物F1：5’-CCTCTACCAGAATAATCATAC-3’、下游引物R1：5’-

8、CAGTGTCCAGTAATAATTCA-3’、探针P1：5’-（FAM）TCTGCCTGCTTGTTCTCTGACT（Eclipse）-3’；N1NA基因引物：上游引物F2：5’-CCCATATCGAACATTGATG-3’、下游引