T∕CVMA 12-2018 猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光R∕T-PCR检测方法

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1、ICS11.220B41团体MA标准T/CVMA12—2018猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光RT-PCR检测方法Real-TimeRT-PCRfordetectionofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus中国兽医协会CVMA2018-10-24发布2018-10-24实施中国兽医协会发布T/CVMA12—2018前言本标准按GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由中国兽医协会提出并归口。本标准起草单位：中国动物疫病预防控制中心。本标准主要起草人：周智、王传彬、杨林、吴佳俊、宋

2、晓晖、翟新验、倪建强、刘玉良、张硕、刘颖昳、赵柏林、顾小雪、曲萍。CVMA中国兽医协会IT/CVMA12—2018猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光RT-PCR检测方法1范围本标准规定了猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）通用型实时荧光RT-PCR诊断技术、鉴别美洲型和欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光RT-PCR诊断技术。本标准主要用于猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)核酸的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适

3、用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T25172猪常温精液生产与保育技术规范NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范执行3试剂与耗材3.1RNA提取试剂RNA提取试剂详见附录A，或选取商品化的病毒RNA提取试剂盒。3.2其他试剂TaqDNA聚合酶（5U/µL），PrimeScriptTMRTMixⅡ反转录酶混合物，50×ROXReferenceDyeⅡ,2×OneStepRT-PCRBufferⅢ缓冲液，无水乙醇，无菌无核酸酶水，生理盐水。CVMA3.3引物探针中国兽医协会3.3.1猪繁殖与呼吸综合征病毒

4、（PRRSV）通用型实时荧光RT-PCR引物和探针，见表1。表1猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）通用型实时荧光RT-PCR引物和探针序列名称序列（5＇-3＇）美洲型上游引物（NAF）TGGARATTCATCACCTCCAGR美洲型下游引物（NAR）GTGCCGTTRACCGTAGTGGA欧洲型上游引物（EUF）ACTTCCAGATGCAGATTGTGT欧洲型下游引物（EUR）GCCGTTCACTGATGTTAGTCC探针FAM-TACATTCTGGCCCCTGCCCAYCA-BHQ注：将表中引物和探针用无菌无核酸酶水稀释至10pmol/

5、µL后使用。3.3.2美洲型和欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒双重实时荧光RT-PCR引物和探针,见表2。表2美洲型和欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒双重实时荧光RT-PCR引物和探针序列1T/CVMA12—2018名称序列（5＇-3＇）美洲型和欧洲型上游引物（NAF-EUF）CGCCAGCCAGTCAATCARC美洲型和欧洲型下游引物（NAR-EUR）GRGGAAAATGKGGCTTCTCMG欧洲型探针FAM-TCCTCCCCTRGGTTGCTGGCGCT-BHQ美洲型探针HEX-YCCCGGTCCCTTGCCTCTGGA-BHQ注：将表中引物和

6、探针用无核酸酶的灭菌蒸馏水稀释至10pmol/µL后使用。4仪器与设备分析天平、高速离心机、荧光PCR仪、组织研磨器、-20℃冰箱、可调移液器。5操作步骤5.1样品采集5.1.1组织样品采集组织样品采集按照NY/T541进行。取病死猪肺脏、淋巴结、扁桃体等组织；待检活猪，采集血液3mL～5mL，也可采取扁桃体样品。5.1.2公猪精液采集公猪精液采集按照GB/T25172的方法进行。5.2样品的处理5.2.1组织样品处理每份组织分别从三个不同的典型病变位置处称取样品约1g，剪碎混匀后取0.02g于研磨器中研磨，加入1.5mL生理盐水继续研磨，

7、待匀浆后转至灭菌离心管中，6000×g离心2min，吸取上清液到新的离心管备用。5.2.2血液样品处理CVMA将采集的血液中国兽医协会室温或者37℃倾斜放置，待血清析出后吸取上清液到新的离心管备用。5.2.3精液样品处理精液样品无需处理，直接用于核酸提取。5.2.4阳性对照样品处理5.0取美洲型和欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性组织研磨上清液各100µL(病毒含量10TCID50/mL)，用于病毒RNA提取。5.2.5阴性对照样品处理取猪繁殖与呼吸综合征病毒阴性组织研磨上清液100µL，用于病毒RNA提取。5.3病毒RNA提取2T/CVMA

8、12—20185.3.1若选用附录A中所列试剂提取病毒RNA，则参照以下步骤进行操作：a)取已处理的样品、阴性对照和阳性对照各100µL，分别加入裂解液600µL，充分颠倒混匀，