H1N1亚型猪流感病毒HA和NA基因双重RT-PCR定型检测方法的建立与应用-论文.pdf

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1、中国动物传染病学报2014，22(4)：29·34ChineseJournalofAnima1InfectiOUSDiseases·研究论文·H1N1亚型猪流感病毒HA和NA基因双重RT-PCR定型检测方法的建立与应用温肖会，蔡春梅，魏文康，翟少伦，吕殿红，贾春玲，袁洁，黄忠，周秀蓉(广东省农业科学院动物卫生研究所。广州510640)摘要：为了建立适用于临床诊断的H1N1亚型猪流感病毒快速检测方法，本研究根据GenBank已登录的H1N1皿型猪流感病毒HA和NA基因序列设计RT-PCR扩增引物，

2、以H1N1亚型猪流感病毒、H3N2亚型猪流感病毒、猪瘟病毒和猪学殖与呼吸综合征病毒为试验对照，通过优化RT-PCR反应条件和反应体系，建立了H1NI亚型猪流感病毒HA和NA基因双RT-PCR定型检测方法。同时，运用H1Nl亚型猪流感病毒血凝和血凝抑制试验方法和本研究建立的方法对165份猪病料样品进行了对比验证。结果表明，本研究建立的H1N1亚型猪流感病毒双重RT-PCR具有良好的特异性、敏感性、重复性，所扩埋的目的基因片段大小分别为428bp和678bp左右，可检出最小基因组RNA浓度为2．9×

3、10一g／L。本研究建立的方法和tI1N1亚型猪流感病毒血凝和血凝抑制试验方法均从同一份猪肺脏样品中检测出H1N1亚型猪流感病毒，其余样品中均未检出ttlN1亚型猪流感病毒，两种方法符合率为100％。本研究建立的方法适用于H1N1亚型猪流感病毒双基因定型检测，可在H1NI亚型猪流感病毒流行病学调查和临床诊断中应用。关键词：HINI亚型猪流感；双重RT-PCR方法；HA基因；NA基因中图分类号：$852．659．5文献标志码：A文章编号：1674．6422(2014)04—0029．06DoUBL

4、ERT-PCRMETHoDSFoRDETECTIoNoFHAANDNAGE_ESoFH1N1SUBTYPESWINEINFLUENZAVIRUSWENXiao—hui，CAIChun—mei，WEIWen—kang，ZHAIShao—lun，LVDian—hong，JIAChun—ling，YUANJie，HUANGZhong，ZHOUXiu—rongrInstituteofAnimalHealth，GuangdongAcademyofAgriculturalSciences，Guangdong

5、51064~China)Abstract：TodevelopareliablediagnosticmethodforH1N1subtypeSwineinfluenzavirus．doubleRT-PCRmethodsW：redevelopedusingprimersdesignedaccordingtothesequencesofHAandNAgenesofH1N1SubtypeswineinfluenzavirusinGenBank．Theamplifiedgenefragmentswere4

6、28bpforHAand678bpforNA．ThereactionconditionswereoptimizedandminimaldetectableRNAconcentrationwas2．9x1O。LJMeanwhile，themethodhadnoreactionwithH3N2subtypeSwineinfluenzavirus，classicalSwinefevervirusandPorcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus．This

7、methoddevelopedhereissuitablefordoubl：genetypingdetectionandalsoforearlydiagnosisandepidemiologicalinvestigationofH1NIsubtypeSwineinfluenzavirus．Keywords：H1N1subtypeSwineinfluenzavirus；doubleRT-PCR；HAgene；NAgene收稿日期：2013—12-2[)基金项目：广东省科技计划社会发展项目(2010

8、B080701024)；广东省科技计划特定任务项目(2011B06070()075)；广州市科技计划项目(2012224—26)作者简介：温肖会，女，硕士，助理研究员，主要从事动物疫病诊断和动物传染病学研究通信作者：魏文康，E—mail：wwk188@tom．com中国动物传染病学报2014年8月流感病毒(Influenzavirus，IV)属于正粘病1．1．2主要试剂和工具酶一步法反转录RT—PCR试剂毒科(Orthomyxoviridae)、流感病毒属，根据核盒、DNAMarker(DL20