DB21∕T 2395-2015 稻瘟病菌无毒基因检测 PCR法

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1、ICS65.020.01B04DB21辽宁省地方标准DB21/T2395—2015稻瘟病菌无毒基因检测PCR法2015-05-18发布2015-07-18实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/T2395—2015前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由辽宁省农业科学院提出。本标准由辽宁省农村经济委员会归口。本标准由辽宁省农业科学院创新中心负责起草。本标准主要起草人：郑文静、陆晓春、王世维、赵家铭、马丽、丛玲、张丽霞、白春明、王春语、王妍、朱振兴、李丹、王平、李金红等。本标准由辽宁省农业科学院创新中

2、心负责解释。IDB21/T2395—2015稻瘟病菌无毒基因检测PCR法1范围本标准规定了检测稻瘟病菌（Magnaporthegrisea）无毒基因的检测方法，包括原理、仪器设备、试剂及样品、防污染措施、实验步骤及结果分析。本标准适用于稻瘟病菌中无毒基因AVR1-CO39、AVR-Pia、AVR-Pii、AVR-Pik、AVR-Pita和AVR-piz-t的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单

3、）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求3术语及缩略语下列术语及缩略语适用于本标准3.1正向引物：处于DNA双链上游的引物，简称F引物。3.2反向引物：处于DNA双链下游的引物，简称R引物。3.3内参引物：在聚合作用起始时，可以刺激合成另一种大分子，并与反应物以共价键形式连接的序列。3.4DNA：DeoxyribonucleosidetripHospHate，脱氧核糖核酸。3.5TE：Tris-Cl、EDTA缓冲液。3.6TBE：Tris-Cl、硼酸

4、、EDTA缓冲液。3.7PrimeSTARHSDNAPolymerase：高保真DNA聚合酶。3.8PrimeSTARBuffer（5×）:5×PCR反应液。3.9dNTP：DeoxyribonucleosidetripHospHate，脱氧核苷三磷酸。3.10PCR：Polymerasechainreaction。1DB21/T2395—20153.11bp：Basepair，碱基对。3.12Goldenview：核酸染料，替代溴化乙锭。3.13DNAMarker：标准分子量的核酸标记。3.14bp:Basepair

5、,碱基对。3.15Tris：tris(hydroxymethyl)aminomethane，三羟甲基氨基甲烷。3.16EDTA：disodiumethytenediaminetetracetace2H2O4原理根据稻瘟病菌无毒基因保守区序列设计特异性引物，提取稻瘟病菌DNA，对试样进行PCR扩增，依据是否扩增获得预期的DNA片段大小及特定的序列来判断样品是否携带该无毒基因。5仪器设备5.1分析天平：感量0.1g,0.01g和0.1mg。5.2瓷质研钵、研杵。5.3具盖塑料离心管：2mL,1.5ml，0.2mL。5.4移

6、液枪和吸头：1000µL,200µL,10µL。5.5水浴锅。5.6台式离心机。5.7NanoDrop2000c核酸浓度测定仪。5.8PCR热循环仪。5.9琼脂糖电泳槽及电泳仪。5.10凝胶成像系统5.11其它相关仪器设备。6试剂及样品6.110%CTAB6.25MNacl6.30.5MEDTA(PH8.0)6.41MTris,pH8.06.5DNA提取缓冲液。2DB21/T2395—20156.61×TE缓冲液。6.75×TBE缓冲液。6.8氯仿:异戊醇（24:1）。6.9异丙醇。6.1075%乙醇。6.11Gold

7、enview（代替溴化乙锭）。6.12干燥的稻瘟病菌丝0.05g～0.1g。6.13引物见附录A除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水或符合GB/T6682规定的一级水。7防污染措施检测过程中防止污染的措施按照GB/T19495.2中的规定执行。8实验步骤8.1试剂配制8.1.110%CTAB：分别称取CTAB10g和NaCl4.1g，加入100mL重蒸馏水，65℃充分溶解。8.1.25MNacl：称取Nacl73.05g，加入200mL重蒸馏水溶解，定容体积到250mL,平均分装。8.1.30.5MEDTA(PH8

8、.0)：称取EDTA46.53g，加入200mL重蒸馏水，调整pH到8.0（约需NaOH5.5g），定容到250mL。8.1.41MTris,pH8.0：称取Tris-base121.9g，加入800mL重蒸馏水，将溶液冷却到室温，调整pH到8.0（约需浓HCl50mL）并定容至1000mL。8.1.5DNA提取缓冲液：10mL1