DB22T 2527-2016 转基因玉米中cry1A 基因定性检测PCR法

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1、ICS65.020.20B05备案号：54204-2017DB22吉林省地方标准DB22/T2527—2016转基因玉米中cry1A基因定性检测PCR法Qualitativedetectionforcry1Agenesingeneticallymodifiedmaize—PCRmethod2016-12-09发布2017-03-01实施吉林省质量技术监督局发布DB22/T2527—2016前言本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015给出的规则起草。本标准由吉林省农业委员会提出并归口。本标准起草单位：吉林省农业科学院。本标准主要起草人：李飞武、

2、邵改革、夏蔚、闫伟、董立明、李葱葱。IDB22/T2527—2016转基因玉米中cry1A基因定性检测PCR法1范围本标准规定了转基因玉米中cry1A基因定性检测PCR法的术语和定义、原理、试剂或材料、试验条件、仪器设备、样品、试验步骤、结果分析与表述、检出限。本标准适用于转基因玉米MON810、MON89034、Bt11、Bt176、Bt506、C0030.3.5、双抗12-5转化体及其衍生品种的植株、籽粒及以玉米为唯一原料的玉米初加工品中的cry1A基因的普通PCR定性检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本

3、适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法NY/T672转基因植物及其产品检测通用要求农业部1485号公告—4—2010转基因植物及其产品成分检测DNA提取和纯化农业部1861号公告—3—2012转基因植物及其产品成分检测玉米内标准基因定性PCR方法农业部2031号公告—19—2013转基因植物及其产品成分检测抽样3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1zSSIIb基因zSSIIbgene编码玉米淀粉合酶异构体zSTSII-2的基因，在本标准中作为玉米的内标准基因。3.2cry1A

4、基因cry1Agene编码苏云金芽孢杆菌（Bacillusthuringiensis）Cry1A杀虫晶体蛋白的一类基因。4原理根据转基因玉米中cry1A基因保守序列设计特异性引物，对试样进行PCR扩增。依据是否扩增获得预期330bp的DNA片段，判断样品中是否含有cry1A基因成分。5试验条件常温条件下。1DB22/T2527—20166试剂或材料除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水或符合GB/T6682规定的一级水。6.1琼脂糖。6.210g/L溴化乙锭（EB）溶液：称取1.0g溴化乙锭，溶解于100mL水中，避光保存。警告——溴化乙锭有致癌作用，配制和使用时应戴

5、一次性手套操作并妥善处理废液。注：可选择其他的核酸染料代替溴化乙锭作为核酸电泳的染色剂。6.310mol/L氢氧化钠（NaOH）溶液：在160mL水中加入80.0g氢氧化钠，溶解后，冷却至室温，再加水定容到200mL。6.4500mmol/L乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）溶液（pH8.0）：称取18.6g乙二胺四乙酸二钠，加入70mL水中，缓慢滴加氢氧化钠溶液（6.3）直至EDTA-Na2完全溶解，用氢氧化钠溶液（6.3）调pH至8.0，加水定容至100mL。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min。6.51mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-H

6、Cl）溶液（pH8.0）：称取121.1g三羟甲基氨基甲烷溶解于800mL水中，用盐酸调pH至8.0，加水定容至1000mL。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min。6.6TE缓冲液（pH8.0）：分别量取10mL三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（6.5）和2mL乙二胺四乙酸二钠溶液（6.4），加水定容至1000mL。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min。6.750×TAE缓冲液：称取242.2g三羟甲基氨基甲烷（Tris），先用500mL水加热搅拌溶解后，加入100mL乙二胺四乙酸二钠溶液（6.4），用冰乙酸调pH至8.0，然后加水定容到1000m

7、L。使用时用水稀释成1×TAE。6.8加样缓冲液：称取250.0mg溴酚蓝，加入10mL水，在室温下溶解12h；称取250.0mg二甲基苯腈蓝，加10mL水溶解；称取50.0g蔗糖，加30mL水溶解。混合以上三种溶液，加水定容至100mL，在4℃下保存。6.9DNA分子量标准：可以清楚的区分100bp～1000bp的DNA片段。6.10dNTPs混合溶液：将浓度为10mmol/L的dATP、dTTP、dGTP、dCTP四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合。6.11TaqDNA聚合酶、PCR反应缓冲液及25mmol/L氯化镁溶液。6.12zSS