DB21∕T 2396-2015 水稻品种抗稻瘟病基因检测 PCR法

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1、ICS65.020.01B04DB21辽宁省地方标准DB21/T2396—2015水稻品种抗稻瘟病基因检测PCR法2015-05-18发布2015-07-18实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/T2396—2015前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由辽宁省农业科学院提出。本标准由辽宁省农村经济委员会归口。本标准由辽宁省农业科学院创新中心负责起草。本标准主要起草人：陆晓春、郑文静、丛玲、赵家铭、王妍、张丽霞、白春明、王春语、朱振兴、马丽、李丹、王平、李金红等。本标准由辽宁省农业科学院创新中心负责解

2、释。IDB21/T2396—2015水稻品种抗稻瘟病基因检测PCR法1范围本标准规定了检测水稻品种抗稻瘟病基因的PCR检测法，包括原理、仪器设备、试剂和材料、防污染措施、实验步骤及结果分析。本标准适用于水稻品种中抗稻瘟病基因pita、pid2、pid3、pik、pikp、pikm、piks、pi21、pi36、pi37和pi5的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分

3、析实验室用水规格和试验方法GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求农业部1485号公告--4—2010转基因植物及其产品成分检测DNA提取和纯化3术语及缩略语下列术语及缩略语适用于本标准3.1正向引物：处于DNA双链上游的引物，简称F引物。3.2反向引物：处于DNA双链下游的引物，简称R引物。3.3内参引物：在聚合作用起始时，可以刺激合成另一种大分子，并与反应物以共价键形式连接的序列。3.4DNA:Deoxyribonucleicacid,脱氧核糖核酸。3.5PrimeSTARHSDNAPolymerase:高保

4、真DNA聚合酶。3.6PrimeSTARBuffer（5×）:5×PCR反应液。3.7dNTPMixture（10mM）:单核苷酸混合液（10mM）。3.8PCR:Polymerasechainreaction。3.9TAE：Tris-Cl、冰醋酸、EDTA缓冲液。1DB21/T2396—20153.10Goldenview：核酸染料，替代溴化乙锭。3.11DNAMarker：标准分子量的核酸标记。3.12bp:Basepair,碱基对。3.13Tris：tris(hydroxymethyl)aminomethane，三羟

5、甲基氨基甲烷。4原理根据水稻抗病基因保守区序列设计特异性引物，提取不同水稻品种的DNA，对试样进行PCR扩增，依据是否扩增获得预期大小的DNA片段及特定的序列来判断样品是否携带该抗病基因。5仪器设备5.1台式离心机。5.2PCR仪。5.3凝胶成像系统。5.4琼脂糖电泳槽及电泳仪等电泳装置。5.5恒温水浴锅。5.6分析天平：感量0.1g、0.01g和0.1mg。5.7具盖塑料离心管：2mL，0.2mL。5.8研钵、研杵。5.9移液枪和吸头：1000µL,200µL,10µL。5.10其它相关仪器设备6试剂和材料6.1供试水稻

6、叶片或种子。6.2DNA提取试剂盒。6.3PrimeSTARHSDNAPolymerase。6.4PrimeSTARBuffer（5×）。6.5dNTPMixture（10mM）。6.6DNAMarker：可以清楚地区分100bp～1000bp的DNA片段。6.750×TAE缓冲液，使用时稀释50倍。2DB21/T2396—20156.8加样缓冲液。6.9引物见附录A。除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水或符合GB/T6682规定的一级水。7防污染措施检测过程中防止污染的措施按照GB/T19495.2中的规定执行。8实

7、验步骤8.1水稻DNA提取按农业部1485号公告--4—2010的规定执行。8.2PCR反应8.2.1将试样DNA、PrimeSTARBuffer（5×）、dNTPMixture、正向引物及反向引物及ddH2O置于冰上融化。8.2.2在0.2mL加盖无菌离心管中，按先后顺序加入：PrimeSTARBuffer（5×）6μLdNTPMixture(2.5mM)2.4μL正向引物及反向引物(100nM)0.2μL(终浓度:0.2μM~0.3μM)，试样DNA1μL（20～100ng）ddH2O20.1μLPrimeSTARHS

8、DNAPolymerase(2.5U/μL)0.3μL用移液枪抽打混匀，盖上盖子短暂离心，置于冰上待用。8.2.3将离心管置于PCR仪中，反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃～61℃退火30s，，72℃延伸30s～60s（每对引物的退火温度及延伸时间参见附录A），29个循环，72℃