基因操作原理06

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1、DNASequencingDNA序列测定第一节Maxam-GilbertDNA化学降解法一、基本原理直接或间接特异性识别4种碱基特定化学试剂可对碱基进行特异性修饰在修饰碱基处(5‘或3’)打断磷酸二酯键ReagentsforMGDNAsequencingBasespecificityBasereactionChydrazine+NaCl(1.5M)Gdimethylsulphate(硫酸二甲酯),methylationA+Gacid(哌啶甲酸),pH2.0，脱嘌呤C+Thydrazine(肼)，打开嘧啶环A>C90C,NaOH(1.2M

2、)，断裂反应哌啶（90C,1M)在修饰位点两端使DNA的糖-磷酸链发生裂解A>CGT+CCAATGGCGCCCACTTC2.ProcedureTemplatesChemicalreactionadefinedDNArestrictionfragmentradioactivelylabeledatoneendwith32PRunningPAGE(7Murea)6%~20%CleavagesatspecificbasesAutoradiographyA>CGT+CCAATGGCGCCCACTTC4.Notesspecificitylengt

3、h(200-250bp)itisbettertoreadMaxamandGilbert’sarticlebeforeaction第二节Sangerdideoxy-mediatedchain-terminationmethod1.CoreprincipleDNAsynthesiswillbeterminatedwhenaddNTPisintegratedPOHOHPOHHPHH3’AGCTCGTAGCATGCATCGATGCATGCTAGCAT5’dATP,dCTP,dGTP,dTTPddATP,ddCTP,ddGTP,ddTTPTempl

4、atedITP3’AGCTCGTAGCATGCATCGATGCATGCTAGCAT5’dATP,dCTP,dGTP,dTTPddATP,ddCTP,ddGTP,ddTTPTemplatedITP3’AGCTCGTAGCATGCATCGATGCATGCTAGCAT5’dATP,dCTP,dGTP,dTTPddATP,ddCTP,ddGTP,ddTTPCCCCCCTemplatedITPC3’AGCTCGTAGCATGCATCGATGCATGCTAGCAT5’dATP,dCTP,dGTP,dTTPddATP,ddCTP,ddGTP,ddTTP

5、CACACACACACATemplatedITPCA3’AGCTCGTAGCATGCATCGATGCATGCTAGCAT5’dATP,dCTP,dGTP,dTTPddATP,ddCTP,ddGTP,ddTTPCATCATCATCATCATCATTemplatedITPCAT3’AGCTCGTAGCATGCATCGATGCATGCTAGCAT5’dATP,dCTP,dGTP,dTTPddATP,ddCTP,ddGTP,ddTTPCATCCATCCATCCATCCATCCATCTemplatedITPCATC3’AGCTCGTAGCATGCA

6、TCGATGCATGCTAGCAT5’dATP,dCTP,dGTP,dTTPddATP,ddCTP,ddGTP,ddTTPCATCGCATCGCATCGCATCGCATCGCATCGTemplatedITPCATCG3’AGCTCGTAGCATGCATCGATGCATGCTAGCAT5’dATP,dCTP,dGTP,dTTPddATP,ddCTP,ddGTP,ddTTPCATCGTCATCGTCATCGTCATCGTCATCGTCATCGTTemplatedITPCATCGT3’AGCTCGTAGCATGCATCGATGCATGCTAGC

7、AT5’dATP,dCTP,dGTP,dTTPddATP,ddCTP,ddGTP,ddTTPCATCGTACATCGTACATCGTACATCGTACATCGTACATCGTATemplatedITPCATCGTA3’AGCTCGTAGCATGCATCGATGCATGCTAGCAT5’dATP,dCTP,dGTP,dTTPddATP,ddCTP,ddGTP,ddTTPCATCGTACATCGTACCATCGTACCATCGTACCATCGTACCATCGTACTemplatedITPCATCGTAC3’AGCTCGTAGCATGCATCG

8、ATGCATGCTAGCAT5’dATP,dCTP,dGTP,dTTPddATP,ddCTP,ddGTP,ddTTPCATCGTACATCGTACGCATCGTACCATCGTACGCATCG