基因操作原理08

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1、第八章DNA文库的构建DNAlibraries基因文库（Genelibrary）：由大量的含有基因组DNA（即某一生物的全部DNA序列）的不同DNA片段的克隆所构成的群体,称之为基因文库。一个完全的基因文库，应该能够保证从中筛选到目的基因。即Genomiclibrary1976年L.Clark,J.Carbon提出了一个完全的基因文库所需克隆的计算公式n=ln(1-p)/ln(1-f)n:一个完全基因文库所应包含的重组体克隆数p:所期望的目的基因在基因文库中出现的几率f:插入片段的平均大小与基因组DNA大

2、小的比值哺乳动物3×109kb若p=99%平均克隆片段20kbf=20kb/3×109n=690773.2E.coli4639221bpp=99%f=20kb/4600kbn=1056.9p=99%f=10kb/4600kbn=2116cDNA文库:若这些大量的重组DNA分子所含的外源DNA不是基因组DNA，而是由某一生物的特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经反转录形成的cDNA，它们所构成的重组DNA克隆群体，则称之为cDNA基因文库一、载体的选择第一节基因组DNA文库的构建可装载的外源DNAPla

3、smid<10kbPhage0-23kbCosmid~45kbBAC~100kbYAC~300kb-1.2Mb粘粒克隆所需的克隆子数是phage的一半，如需700000时，cosmid需350000个如无特殊需要(如单个phage不能包容靶基因片段或要分离一系列跨过染色体DNA特大区段的重叠克隆时)一般不采用cosmid，因其在构建文库和贮存文库比phage困难得多YAC可用于克隆500kb以上，甚至几Mb的DNA片段BAC可减少DNA分子间的重组1．phagevectors早期（70年代后期

4、）使用，如Charon4A和gt-WES，克隆15～20kb目前用EMBL系列,2001，DASH，Charon38-40，GEM-11等置换型载体，插入片段的最大值可达20-24kb·选择载体要考虑的因素易于从重组噬菌体中回收插入的外源DNA易于制备两臂载体的可知性，如序列，图谱载体臂上的琥珀突变，利用特殊筛选系统重组体中有活性的gam基因载体臂上的chi序列2．Cosmidvector所有cosmidvector均可用于构建文库，但建议尽量使用pJB8和c2RB，因为经验较多，许多问题易于解决

5、二、用phage构建文库1．总DNA的提取DNA初始长度应至少是用于克隆的片段的4倍，否则有效片段较少，因此DNA至少应大于100kb（cosmid200kb）2．载体臂的制备·购买·载体制备、纯化·限制酶消化BamHI/EMBLXhoI/GEM-11·载体臂的纯化（梯度离心：蔗糖或NaCl）梯度离心的收获量大，而agarose回收量小回收无填充片段聚乙二醇沉淀，除去碎片置换型载体coscosRLCentralstuffer3．基因组DNA的消化一般采用Sau3AI消化回收20-24kb（agaro

6、se法or梯度离心）·有些载体可做不完全补平4．连接/包装连接形成较长的多联体，包装成粘粒（4℃6个月稳定）5．扩增和保存重组phage可在E.coli中扩增，所得文库可被长时间利用和贮存，可用于多个不同基因的筛选6．在宿主菌上形成噬菌斑7．带有目的外源DNA序列的phage重组体的鉴定8．对选出的重组phage进行噬斑纯化，再对外源DNA进行分析载体的去磷酸化，提高连接和包装效率双酶切消化载体（EMBL系列，2001，XDASH，Charson40,35,34）EMBL3A:SalIBamHIEc

7、oRI------E1B1-S1连接反应中，应测定外源片段与载体的比例phage108pfu/gDNA若用BamHI和EcoRI双酶切，可用异丙醇沉淀或其它柱层析法去除小片段，使非重组体的数目降低2个数量级，结合其它方法如Spi筛选可再降低2-3个数量级基因组DNA片段3’凹端的不完全补平-GATC--CTAG--GATC--CTAG-Sau3AI-GAGATC--CTAGAG-KlenowdATP/dGTP-CTCGAG--GAGCTC-XhoIKlenowdCTP/dTTP-CTCTCGAG--G

8、AGCTCTC-互补GEM-11基因组DNAVector三、重组体的筛选和分析噬斑原位杂交将噬菌体以一定密度铺于平板，并影印到固相膜上要从哺乳动物DNA文库里筛选出目标基因，哺乳动物基因组复杂度为3×109bp，必须筛选几十万个噬斑不同大小的培养皿所能容纳的噬斑数目.杂交筛选用探针.纯化.分析/Southern杂交，酶切Sequencing/其它方法，如免疫学方法四、亚基因组文库的构建用基因组DNA的特定部分所构建的基因文库