基因操作原理07

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1、突变类型：简单的插入或缺失系统的缺失、插入或成串碱基的置换单个碱基的置换第七章定点诱变site-directedmutagenesisofclonedDNA第一节寡核苷酸介导的诱变oligonucleotide-mediatedmutagenesis70年代初×174DNA(ssDNA5386bp),当用带琥珀突变的ssDNA与变性的野生型DNA片段一起转染细菌时,观察到“标记获救”现象即产生带野生型基因组的噬菌体，原因是野生型DNA片段与突变体的相应序列退火，形成错配的异源双链体，后者可被宿主编码的

2、错配修复系统转变为全长的野生型基因组。由此可利用突变的DNA片段将突变引入到野生型DNA中。dut-dUTP酶缺陷，细胞不能把dUTP转化为dUMP,因此细胞内dUTP的含量大为增加，其中一些dUTP可掺入DNA中正常情况下由胸苷嘧啶占据的位置一、Kunkel法或称“U”法ung-UDG酶缺陷,UDG酶[尿嘧啶(uracil)-N-糖基化酶(glycosylase)]可除去掺入DNA中的尿嘧啶残基1．背景知识dut-/ung-合成的DNA含有尿嘧啶，M13噬菌体DNA中将含有20-30个尿嘧啶碱基E.c

3、oliCJ236dut,ung,thi,relA;pCJ105(Cmr)pCJ105isaF’plasmidVectorM13mp18pTZ18U/19U2860bpUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUInserttargetDNA转化E.coliCJ236M13K07感染IsolatephagemidssDNA与突变寡核苷酸退火T4orT7DNApolymerase/ligase转化MV1190dut+/ung+2．原理(1)DNApolymeraseT4,T7,Klenow(可能会替换引物)65

4、%11/13(84.6%)36%突变率(2)ligase3U/13l可有可无，有则效率高(3)T4gene32protein提高含二级结构的ssDNA的突变率3.酶和primer(4)primer要求5’端磷酸化引物的终极条件：与靶DNA正确配对特异性地与靶DNA序列退火A.单核苷酸置换插入or缺失5’端完全配对，使得上游(引物)起始的DNA合成不容易将诱变寡核苷酸取代，约需8-10bp3’端所形成的杂交体足以引导DNA合成。如果错配核苷酸太靠近3’端，3’端将不能形成稳定的杂交体，易被外切活性降解。

5、所以3’端需有7-9bp完全配对;为便于筛选，应选用可形成稳定杂交体而长度最短的诱变寡核苷酸。一般17-19bp,错配在中央，使得完全配对的杂交体与错配杂交体之间的热稳定性差异足够大。B.多处缺失或变换2个bp以上的oligo两侧需12-15bp侧翼双链区的Tm应约为35-40℃Tm=4(G+C)+2(A+T)=36℃(3each)突变区域大,效率越低(两侧形成稳定杂交体的能力是突变区长度的函数→越低）(5)模板/结果靶DNA尽可能短，应测序确定其突变载体pTZseriesM13mp18pUC118/1

6、19二、AlteredSites®IIinvitroMutagenesisSystem三、TransformerSite-Directedmutagenesis四、PCR定点诱变1．同源重组法2．DpnI法3.重叠延伸Overlapextension(二)PCR定点诱变1．同源重组法2．DpnI法3.重叠延伸Overlapextension(三)SOE重叠延伸剪接术Splicingbyoverlapextension第二节嵌套缺失1.外切核酸酶III的消化详见DNAsequencing2.BAL31的消

7、化主要活性为3’外切核酸酶活性，可从线性DNA两条链的3’端去掉除单核苷酸，还是一个内切核酸(单链，nick,gap)依赖Ca++EGTA可抑制活性AABAdigestionvectorinsertBAL31BdigestionDeletedinsertsclonedtoplasmidvector3.DNaseI的消化内切酶，可优先嘧啶核苷酸水解dsorssDNAMg2+:独立作用于每条DNA链，位点随机Mn2+:大致在同一位置切割dsDNA产生平端或1-2个核苷酸突出cccDNADNaseI,Mn++

8、(lowconcentration)AdigestionKelnowre-ligation