基因操作原理04

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1、第四章大分子的分离和分析一、E.coli质粒DNA的分离和纯化1．质粒DNA的小量提取第一节DNA的分离、检测和纯化1．质粒DNA的小量提取①步骤性原理在碱性条件下，线状DNA变性，质粒DNA维持环状，高盐条件下复性，除质粒DNA外，形成沉淀。②步骤细菌培养物的生长、时间、量细菌的收获和裂解质粒DNA的纯化（苯酚/氯仿梯度离心）SolITris-HCl,EDTA,GlucoseSolIINaOH-SDSSolIII3MKAcDNApurificationKit(QiaGen)二、DNA的电泳检测主要检测：分子量，含量

2、及有无1.琼脂糖凝胶电泳琼脂糖从海藻中提取的一种线状高聚物常规熔点低熔点Gellingpoint25℃20-30℃Meltingpoint65℃电压迁移率与电压成正比2kb应5U/cm电场方向单一方向负→正脉冲电场几百kb以上温度4℃-30℃，0.5%or低熔点4℃bufferTAETBETPE50mM(pH7.5～8.0)．碱性agarose电泳用于分析ssDNA/Southern杂交londingbuff溴酚蓝/二甲苯菁FF40%Sucrose染色/摄影EBt0.5g/ml10mg/mlstore(棕色瓶

3、or铅铂纸)UV波长：长366nm,短254,一般3022.聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）优点:分离率高1bp,点样量高10g回收的DNA纯度高非变性:迁移率与序列和组成有关变性(尿素/甲醛):无关，分离探针，S1酸产物分析，DNA测序三、DNA片段的纯化（从agarose）1.低熔点agarose电泳gel+5voltris65℃5minphenolextractethanol2.透析袋，电洗脱法可用于5kb3.GlassMilk(bead)3MNaI溶液，bead吸附洗涤elute4.KitQiagen公司一

4、个典型哺乳动物细胞约含10-5gRNA，其中80-85%为rRNA(28S,18S和5S/23S,16S,5S)三种类型)，其余15～20%主要由各种类型的低分子量RNA组成（如tRNA，核内小分子RNA等）。mRNA为总RNA的1～5%，3‘端有一个poly(A)尾，可与oligo(dT)-纤维素，吸附，亲和层析分离寡脱氧胸苷酸。第二节RNA的分离、纯化和检测一、注意事项-----控制RNA酶的活性(一)实验用具和溶液的去RNA酶处理1.玻璃制品、塑料制品、电泳槽一次性使用用品/第一次使用的用具，可稍作处理器皿：

5、180℃8hrorlonger，氯仿冲洗/NaOH/专用溶液0.1%DEPC(焦碳酸二乙酯)、浸泡(37℃，2hr)(RNA酶的强列抑制剂，但不绝对)无菌水(orDEPC水)洗涤100℃烤15min→湿热灭菌电泳槽:洗净,水冲洗,乙醇干燥3%H2O210min0.1%DEPCH2O水洗2．H2O：0.1%DEPC溶液：用DEPC水配制（注意有些药品，不能用DEPC,如Tris）3．其它如手套，保持干净、清洁（二）RNA酶抑制剂1．蛋白质抑制剂人胎盘RNase抑制剂2．氧铜核糖核苷复合物100%抑制（且抑制体外翻译）3

6、．硅藻土，吸附RNase二、RNA的抽提1．文献法2．KitGibco/TR1ZOLReagent100ml99.8USD酚+异硫氰酸胍Qiagen/RNAeasy三、纯化1．蛋白质的去除（见上）2．DNA的去除DNaseI（RNasefree）inhibitor3．Kit4．梯度离心四、mRNA的纯化1．亲和层析2．纯度检测OD260:1=40g/mlRNA五、电泳1．琼脂糖凝胶氢氧化甲基汞甲醛乙二醛-二甲基亚矾（DMSO）2．PAGE1．检测蛋白质分子量2．Westernblot3．N-torminalamin

7、oacidsequence第三节蛋白质的SDS-PAGE第四节分子杂交molecularhybridization1.根据被杂交的对象分为Southern,Northern,Western,Dot,colony(plaque)2.denature变性：热，极端pH，有机溶剂，尿素annealing复性：互补单链重新配对恢复成双链为复性hybridization杂交：同源单链重新配对恢复成双链为杂性一、Southernblot(一)DNA片段的转移1．酶切2．电泳/照相中性／碱性（0.4N,NaOH）3.变性/中和大片

8、段脱嘌呤0.2N,HCl10min0.5NNaOH/1.5MNaCl1MTris(pH7.4)/1.5MNaCl4.转移NitrocellulosemembraneNCnylonmembrane(chargedornot)6×SSC(orSSPE)转移buffer毛细管电转移真空滤纸凝胶滤膜吸水纸玻璃板重物支持物500g时间:<1kb<1hr,