转基因大豆研究进展

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大豆转基因的研究进展王利云09243406盐城师范学院盐城2214000摘要：近年来利用基因工程技术，大豆的遗传转化取得了较大的进展。该文介绍了几种主要的大豆遗传转化系统的优点和缺点，探讨了影响农杆菌介导大豆遗传转化的因素。分析了大豆遗传转化中存在的一些问题及其解决办法，评价了转基因大豆的牛•物安全性,展望了未來大豆遗传转化的发展询景。关键词：大豆；转化系统；生物安全性；中图分类号：Q789文献标识码:A文章编号:1004-31IX(2011)06-0083-07ResearchProgressonTransgenicSoybeanWANGLi-YunYanchen^TeachersUniversity2214000Abstract:Theseyearsthegenetictransformationofthesoybeanhadbeenmadebigprogresswiththetechnologyofthegeneengineering・Thispa2pcrreviewedtheiradvantagesandlimitationsofvarioustransformationsystems・ApproachthefactorsofthegenetictransformationofthesoybeanoftheAgrobacterium,analysethecurrentproblemsandtheirsolutionsandevaluatethebiosafetyoftheansgenics-oybean.Intheendfuturepros2pectofthesoybeantransformationwasdiscussed.Keywords:soybean;transformationsystems;biosafety大豆｛GlycinemaxL.）是属于豆科、蝶形花亚科植物。它起源于中国是人类主要植物性蛋白来源之一，在国际贸易中位居主要的汕料作物。而且是重要的家畜饲料和许多工业原料，在更学上也有很人价值。因而是一种非常垂要的农作物。随着某因工程研究的深入，用转基因技术来改良品种的性状已在许多作物上应用。虽然转棊因大豆的大HI性状已经商业化,但是相対于水稻、烟草等作物來说，人豆的高效遗传转化一直是植物基因工程领域的难点之一。本文综述了大豆几种遗传转化体系及影响农杆菌介导大豆遗传转化因素,分析了大豆遗传转化中存在的一些问题及其解决办法,展望了未来人豆遗传转化的发展前景。根据植物遗传转化的原理，可以将植物遗传转化方法分为三大系统:载体转化系统，包括农杆菌介导法（根癌农杆菌Ti质粒和发根农杆菌Ri质粒）和植物病毒载体法;种质转化系统，包括花粉管通道法、胚囊和子房注射法、萌动种胚浸泡法;DNA直接导入的基因转化系统，包括物理法（基因枪法、超声波法、电激法等）和化学法（PEG法、脂质休法）tl]o目前用于大豆的转基因方法国外主要以农杆菌介导法、基因枪法为主;国内主要是超声波辅助农杆菌转化法和花粉管通道法。其它直接介导法应用较少。 1遗传转化体系1.1农杆菌介导法1.1.1农杆菌发展简介农杆菌介导法是获得笫一个转基因植物的方法。1988年Ilinchee等首次报告了农杆菌成功转化大豆的事例，他们以子叶为受体材料,gus(P-glucuronidase基因)为报告基因,筛选npt(neomycinphosphotransferaseII)基因，抗生素筛选后获得的植株中冇6%是转基因植株，认为Ti质粒或Ri质粒的T-DNA区、Vir区与农杆菌染色体基因问的相互作用和协作使T-DNA区和在其中插入的外源基因从农杆菌转入植物细胞,T-DNA的转移过程至少包括4个步骤：(1)农杆菌积聚；(2)农杆菌致毒系统的诱导；(3)T-DNA转移复合物的形成；(4)T-DNA转入并且整合入植物基因组。日询,人豆农杆菌转化多采用的是改良叶盘法，外植体主要是子叶、下胚轴和子叶节。用农杆菌介导进行大豆的转基因研究是从野生型菌株开始的。2002年，王罡等研究了人豆基因型対根癌农杆菌的敏感性,认为不同大豆基因型对根癌农杆菌的敏感性存在显著差界I?1。YanB等⑶用农杆菌转化未成熟合子，经体细胞胚再牛系统获得了转基因大豆植株。在初始大豆转化体内T-DNA的整合与gus-intron基因的表达被Southern杂交与GUS试验证实。KeJ等⑴利用禽有gus基因与npt-II基因以及virGN54D突变的根癌农杆菌的超毒突变体AD690、AD691和AD692，高效地将GUS某因转入人豆无菌苗的不同部分，转化率增加12.6%〜51.8%。然而，非常遗憾的是没冇产生大豆的转化愈伤组织和植株。发根农杆菌介导转化大豆有许多报道，除Owen和Cress的Ri质粒易感性研究外,Kumar等川野生型Ri质粒和带重组质粒的发根农杆菌转化野生大豆获得了抗性愈伤组织。1996年,徐香玲等用Ri质粒的发根农杆菌(PRiA4b)，将人豆花叶病外壳蛋白基因PES导入人豆品种中。通过发根农杆菌转化人豆子叶,把大豆Adh2基因的启动子Adh(976bp)转入大豆发状根内。其中5个转基因发根品系表现出启动子可以被生长素诱导而不被低温、创伤和ABA诱导的特性⑸o対两种类型的转基因植株后代进行遗传学分析表明，外源基因是以单拷贝整合进大豆基因组。此外，以子叶节、子叶、下胚轴和未成熟子叶等为外植体用农杆菌介导法Bt基[S]161、Barnase基因'」导入大豆中。SchmidtMA等"」将crylAC转入大豆，得到了转基因植株。2003年，卜云萍等报道采用农杆菌介导的大豆子叶节转化系统成功地将抱酶△6-脂肪酸脱红酶基因导入豆s。1.1.2农杆菌方法的优缺点此法具有技术简单成熟,耗资少，可靠性高，转化率相对较高，可以转移大片段外源基因(>30kb)，没有明显的基因重排现象,外源基因主要以单拷贝插入植物基因纽等优点。但是它却受宿主范围和菌株特异性等因素的制约⑼1-1.2基因枪转化法1.2.1基因枪转化法简介基因枪转化法又称微弹轰击法(microprojectilebombard2ment),是最广泛地应用于一些对农杆菌不敏感的植物的转化方法。1991年,Finer和McMullen首次报告用基因枪法转化体细胞胚性细胞团并获得了转基因植株，以后这一系统得以快速发展，成为人多数实验室采用的手段。Hazel利用基因枪转化法，发现小于6个丿J培养时间的悬浮培养胚性细胞其转化效率极低。用较老的胚性细胞作靶组织获得的再牛植株，形态较为异常。植株的染色体常发生缺失、重复、三体和四体变异oHadi等用12个质粒、SimmondsDII等用两个质粒分别研究了多个质粒混合轰击共转化的效果:，经hygromycin抗性筛选和Southern杂交检测，证明得到了共转化的克隆和再生植株口门o2002年，王萍等在研究影响基因枪转化效率时发现，未成熟子叶被轰击后在高渗培养基中停留的天数是影响大豆转化率的主要因素Z—[12)1.2.2基因枪转化法的优缺点 该法把利用被加速的、包被着DNA微米大小的微颗粒轰击植物组织细胞,将外源基因转移至几乎所有的植物细胞、组织器官和原牛质体。对DNA的转移过程与基因型的依赖性没有任何生物限制。因此能够产生微创有利于基因转移而具有相对较高的转化率,能够转移多拷贝的重纟H.DNA或者DNA片段〔心。其缺点是基因枪法比农杆菌介导法耗资大，技术难，转移DNA分子量-•般不髙于10kb，在植物基因组中拷贝数高，易引起基因沉默等。1.3花粉管通道法1.3.1花粉管通道法简介花粉管通道法是利用植物授粉后所形成的天然花粉管通道,将外源DNA导入受体植物基因组中。花粉管通道法的基本原理是植物授粉后,花粉在雌蕊柱头上萌发形成花粉管通道，使外源DNA或基因进入胚囊，转化受糟卵或其前后的细胞（卵、早期胚细胞）而自然发育成种子，观察其后代的变异，筛选出转基因植物。刘德璞在大豆中导入高抗花叶病的外源DNA，获得了生育期、生长习性、株高、节数、分枝数等倾向供体的变异性状,•且对SMV的抗性也得到了提高。胡张华等将反义PEP基因转入浙春3号大豆品种中获得再生植株,并得到PCR检测结果。徐香玲等将几丁质酶基因转入大豆栽培品种中获得再生植株，斑点分了杂交证明了几丁质酶基因已转入大豆中。该法将高蛋白野生大豆Glycinegracilis（蛋白含量为50%）的总DNA转入栽培大豆，获得了高产高蛋白（45.44%）大豆品种黑生101。用这些方法可以转移单基因孟徳尔遗传的性状和多基因数量性状。1.3.2花粉管通道法优缺点花粉管通道法简单易行，己被许多育种工作者所采用，并培育出-•批抗病、抗虫及其他优良性状的农作物新品种或新品系。它的优点是：（1）利用整体植株的卵细胞、合子或早期胚细胞转化D7A,无需细胞、原牛质体等组织培养和诱导再生植株等一幣套人工培养过程。（2）方法简捷,nJ在大田、盆栽或温室中进行。（3）单胚珠和多胚珠的单、双子叶植物均可以应用。（4）育种时间短。在口花授粉的基础上只有部分外源DNA片段进入受体基因组，避免了供体基因与受体基因组全而重组。比较稳定。（5）可任选植物品种进行外源DNA导入，达到日的性状基因的转移。而H可以保留受体的优良性状，无需考虑体细胞变异的问题。（6）该技术也适应于重组D7A分子的导入。缺点是其转化频率很低，重复性也不太高。1.4超声波辅助农杆菌转化方法超声波辅助农杆菌转化法是近年发展起來的一种遗传转化方法。超声波基因转化的基本原理是利用低声强脉冲超声波的物理作用，击穿细胞,使外源DA进入细胞。在进行农杆菌转化时用超声波处理外植体组织，使转化的靶组织内部或表而产生人量的微小伤口，有利于农杆菌进入杭物细胞内。TrickHN等用扫描电镜及光学显微镜观察发现，超声波处理后使外植体表面及近表面产牛大屋的细小贯穿通道,农杆菌易于与植物细胞接触，从而促进转化过1,41o1998年TrickHN等和Santarem等用SAAT法转化大豆胚性悬浮细胞发现农杆菌能顺利地进入胚性愈伤组织内部，并且发现超声波处理材料2s时，在27°C共培养3d,GUS表达髙达36%,得到了含有外源基因的抗性愈伤。然而，未经超声波处理的子叶只有平均不到1%的GUS表达。FinerJJ等SAAT法转GFP基因获得相似的结果（心。2影响农杆菌介导大豆遗传转化因素2.1基因型及转化受体基因型是影响农杆菌介导人豆转化的重要因素之一。1998年Hinchee等从100多个品种中选出了对农杆菌反应最佳的Poking,说明基因型不同的株系对农杆菌的反应能力不同。1991年Kumar等用野生型Ri质粒和带重组质粒的发根农杆菌转化野生大豆发现，农杆菌的感染能力与大豆基因型有关，同时大豆的易感性还与发芽天数、接种时间和培养条件等多种因素有关。进一步研究表明易感性是受少数儿个基因控制的数量状。通过试验发现选择基因 型时要首先看其栽培性状如何，再试验其再生能力，最后作感染试验，从中选出比较适于农杆菌转化的基因型［叮0目前农杆菌介导法转化大豆采用的外植体主耍是子叶节。2004年Liu等采用了再牛能力较强的胚尖再生系统，转化频率对达&0%〜15・8%，另外农杆菌介导由未成熟胚诱导而来的胚性细胞转化也有了新的进展，这三种外植体将会成为今厉农杆菌介导转化的主要受体。1.2农杆菌菌株大豆易感性与农杆菌菌株有关，目前用于遗传转化的主耍菌株是EHA10KEHA105和LBA4404o就效果Ifij言EHA105使用最为广泛，它和EHA101都是超毒力(hypervirulent)菌株。2003年Ko筹发现农杆菌菌株KYRT1在介导人豆转化方而效果明显优于GV3101和EHA105。转化屮选择对农杆菌敏感的人豆基因型和强毒农杆菌菌系有利于转化效率的提高。农杆菌对大豆外植体感染能力的措施就是在共培养培养基里添加硫醇类化合物"1,通过缓解植物对农杆菌的防卫反应造成的组织坏死來增加T-DNA向外植体的转移频率。李洪泉等用Chry5对10份大豆品种致瘤研究表明不同农杆菌菌株致瘤能力存在差界，且与基因型有关otfijByrne等用11个菌株对Peking的转化研究表明，不同菌株致瘤能力的差异，主要是Ti质粒差界造成的，胭脂碱型Ti质粒转化能力强于章伯碱型Ti质粒，且农杆菌的致瘤能力与Ti质粒屮的致毒基因冇关。1.3筛选剂、酚类化合物及其他因素对农杆菌介导转化的影响目前大豆的遗传转化应用最广泛的筛选剂是卡那霉素(kanamycin)。Aragao叮L等采用ahas基因为筛选标记，编码的产物能引起植株对咪岬酮类除草剂的敏感,但该筛选剂还没有应用于农杆菌介导的转化上o2004年Olhoft等采用潮霍索作为筛选剂应用于农杆菌介导大豆的遗传转化，也获得了很好的效果。由上可知应用于大豆遗传转化的筛选标记并没冇严格的限制，儿种在英他作物己获成功的筛选剂都可以使用。酚类化合物如乙酰丁香酮(AS)等对农杆菌的转化能力有明显的影响。增加AS和调节共培养时培养基的pH能提高农杆菌的致毒力，但不同的菌株对AS反应不同。人豆子叶节农杆菌介导转化共培养时，加入AS抗性愈伤率提高35%,加入马铃蒋悬浮培养物抗性愈伤率提高64%o加入半胱氨酸浸染率从37%提高到91%，稳定的T-DNA转移率增加5倍，转基因效率提高2倍。用烟草提取物处理农杆菌菌液也能提高转化率。另外，近期报告指出筛选策略对实验也有较大的影响，即共培养后先采用恢复培养(即零浓度的筛选剂)，待外植体恢复正常的生长活力后再采用较高的筛选浓度，待生根时则再降低筛选剂的浓度这样易于获得转某因的小植株并能获得较高的转化效率。不同农杆菌与质粒组合是转化重要因素Z-o此外，大豆农杆菌转化还受到大豆外植体类型、诱导条件、共培养时间等多种因素的影响。3大豆遗传转化的主要障碍及解决办法2.1主要障碍2.1.1转化体系不完善尽管已有几种大豆转化法获得了可育的转基因大豆植株，抗除草剂转基因大豆己经商晶化，但大豆的遗传转化率低、重复性差，多为单基因转化是转基因研究的主耍问题。目前主要靠大量的转化受体來获得转基因植株。因此，进一步研究影响大豆遗传转化的因素尤为重要。从所转化的外源目的基因看,主要是转抗除草剂基因、Bt基因和儿丁质酶基因等抗虫、抗病的单个基因。在植物转某因研究屮，一个潜在的严垂问题是害虫和病原体对单基因可能会产生抗性或耐受性。在基因构建时应采用组织专一性启动子或化学诱导启动子，或者同时转入多个基因，如转抗虫基因时,可同时使用两个以上Bt基因转化农作物或联介Bt基因和其他类型的抗虫基因（CpTI或Gna）。昆虫对两种独立杀虫剂同时产生耐受性棊本上是不可能的。因此,使用双价抗虫（或抗病）基因可能是今后大豆转基因的一个方向。 1.1.2亟待解决的问题（1）转基因大豆植株常常出现恢合休，转基因不传递到其后代，尤其绝大多数转基因大豆植株是不育的；（2）需要进一步促进外源基因的稳定整合及其表达的正调控：（3）目前转入大豆具有实用价值的农艺性状的基因非常少。到日前为止，通过改进人豆的选择和植株再生、改造V让基因构件、优化可疑大豆表型的鉴定和筛选方法［叮，通过在培养基内附加vir区基因的化学诱导剂增强农杆菌的致毒力，通过利用超声波、轰击和真空抽滤等方法增加外植体的创伤，大豆的转化频率有所提高，但获得转基因大豆的效率还相当低，有必耍研发更有效的技术方法进一步提高转化率。3.2转基因大豆的生物安全性问题虽然抗除草剂转基因已用于商业化生产,高汕酸、高赖氨酸转基因人豆已进入人出试验,但大豆转基因农产品的安全性问题受到普遍关注。口从1994年美国政府笫一次批准商业化牛产延熟转基因西红柿以來，转基因作物牛产迅猛发展，种植面积和总销售额逐渐增加（衣1）t2°_22Io表11995〜2005年世界转基因作物种植面积和销售额Table1WorldwideGMC-growingareaandgrosssalesfrom1995to2006年度Year种植面积(百万hn?)GMC-growingarea(millionhm2)总销售额(百万$)Grosssales(miIlion$)19951.27519962.84235199712.55670199827.81640199939.92100〜2300200044.23000200152.65000200295.710470200383.654000200481525002005905600020061025846002001年，全III：界转基因作物的种植面积为52.6百万hm2,全惟界大豆的种植面积为72.0白万hm2o转基因人豆的种植而积为33.3白万hm2,分别占63%和46%。从1994年美国Monsanto公司的抗除草剂（抗草丁瞬）大豆首次获准商业种植后，转基因大豆得到迅猛发展。这是因为转基因大豆产品费用比传统大豆产胡费用低30%〜50%，而产量却增加15%〜20%。2003年通过共抑制技术获得的无过敏转基因大豆研制成功。山于近些年涉及到生物安全性问题，欧洲反对使用转基因作物食晶。一般认为对转基因作物应该考虑6个生物安全性问题。转移基因、杂草化、性状效应、遗传与表型的改变、病原遗传物质的表达和工作人员的安全。其屮最人风险Z—是“杂草化”，包括抗性作物自身“杂草化”，抗性棊因“漂移”到杂草上，导致抗性杂草的产生。此外还存在对环境的影响、食品的安全性、抗性基因的稳定性、加速抗性杂草发生等问题。Monsanto公司对抗草甘麟转基因大豆品种402322进行•仓品安全评价的结果表明，它的内含物和普通人豆品种没有差异。然而，抗除草剂转基因作物的食品安全性也存在不可预见性,不可能在短短的儿年内作出肯定的冋答，必须进行长期监控。试验表明,草甘麟可使豆科植物产生一种植物雌激素，食用后会破坏生殖系统。它能在土壤中存册很久，危害动物和环境。比利时科学家也发现抗草廿 磷转基因大豆中发现来源不明的534bpDNA片段，与报道的大豆序列没有同源性。不过仅根据上述问题，尚不能得出转基因作物安全与否的结论。所以侮一种新研制的转基因作物都必须通过个案处理，评估其可能存在的风险，以确保进行环境释放和市场释放时转某因作物及其加工的仓品具有安全性。4前景展望中国的牛物技术水平，在转基因抗虫棉和转基因水稻方面处于世界领先水平。但作为世界笫四位大豆主产国，中国的转基因大豆研究却尚在起步阶段，这是一个令人遗憾的现实。中国以传统大豆为特色的大豆产业将面临美国的转基因大豆的直接竞争。从国家发展战略高度看,粮食安全始终都是第一位的。如果把人豆的供应完全寄托在外国供应商疗上，就必定会受制于人⑼］O所以屮国大豆产业应和其他主要农作物一样，大力加强大豆转某因生物技术的研发，早口创造出产权属于我们自己的、具冇中国特色的、建立高效的大豆遗传转化受体系统的安全的转基因大豆。为了能够提高对转基因大豆的监督检测能力,应进一步研制转基因大豆DM检测芯片；而大豆基因组计划的启动也必然会导致大批有重要农艺性状的基因被克隆，这样又会促进大豆基因工程的全面展开，从而不再局限于抗虫、抗除草剂等的研究，真正从分子水平有针对性的改良人豆的品质。那时才意味着大豆基因工程春天的到来，而人类也必将因此更加受益。参考文献：[1]李文霞庁海龙，李文滨.人豆遗传转化系统的研究进展卩].中国农学通报,2005,12(21):67-71.[2]赵晓雯，吴芳芳,狄少康，柏锡，纪巍，李勇，才华，朱延明,.农杆菌介导的人豆子叶节遗传转化技术流程及操作耍点IJ].大豆科学,2011,(3).|3|YanB,SrinivasaReddyMS,CollinsGB,e(al・Agrobacteriumtumefa2ciens一mediatedtransfor・mationofsoybean[Glycinetnax(L.)Merrill]usingim2maturezygoticcotyledonexplants[J]・PlantCellReps,2000,20:1090-1097.[4]KeJ,KhanR,JohnsenT,etal・A.Highefficiencygenetransfertorecalci2trantplantsbyA^robacteriumtumefaciens[JJ・PlantCellReps,2001J8:150-156.[5]练云,梁款珍，王树峰，余永亮,王庭峰，位艳丽,.农杆菌介导大豆遗传转化研究进展及转基因作物现状[J].大豆科学,2009,⑶.[6]李海燕,.人豆转基因的研究进展[J].生物技术,2007,(6).⑺张银霞，宋晓华,李英慧，邱丽娟,.农杆菌介导的人豆转基因研究进展[J].大豆科学,2006,(3).[8]SchmidtMA,ParrottWA.Quantitativedetectionoftranscenesinsoybean[Glycinemax(L.MerrillJandpeanut(ArachishypogaeaL.)byreal-timepolymerasechainreaction|J].PlantCellReps.,2002,17:752・759.[9]卜云萍，王广科,胡国武.深黄被抱酎46脂肪酸脱氢酶皋因导入人豆[J].生物技术,2003,13⑶:6-8.[10]李涛，蒋春志,赵青松，张孟臣,.大豆转基因力法的研究进展[J].安徽农业科学,2009,(22).[1IJSantaremER,TrickHN,EssigJS,etal.Sonication-assistedAgrobac2terium-mediatedtransformationofsoybeanimmaturecotyledons:oplimizationoflransientexpression[J].PlantCellReps,1998,17:752-759.[⑵王萍,王罡，季静，等.大豆转基因体系的研究进展[J].遗传,2004,26(6):969-976.[⑶武小霞,李文滨，张淑珍.我国大豆转基因研究进展[J].大豆科学,2005,(2).[14]TrickHN,FinerJJ•SonicationassistedAgrobacteriummediatedtransfor2mationofsoybean 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