分子诊断和基因治疗应用前景

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1、分子诊断和基因治疗应用前景长期以来，疾病的诊断主要依据病史、症状、体征和各种辅助检查，如血液学、病理学、免疫学、微生物学、寄生虫学乃至物理学检查等。然而，上述检查方法都具有其各口的局限性，使得许多疾病未能被及时准确地诊断，从而延误了治疗良机。因为许多外科疾病在病人出现症状、休征及生化改变之前就已存在相当一段时间，所以人们一直在盼望能找到一种技术，在疾病一旦发生，甚至询未出现症状、体征及生化改变之前，就能作出诊断；对于某些可能的致病因索，包括食品、水质、环境中存在的病原体，人们也期望能有简单准确的方法及时进行检测。分子生物学技术的发展使人们渴槊已久的上述愿槊得以实现，这种在分子生物学理论和技术

2、发展基础上建立起来的一门全新的诊断技术就是分子诊断。生物大分子主要指核酸（DNA和RNA）和蛋口质，通过从分子水平上完成DNA,RNA或蛋白质检测，从而对疾病作出诊断的方法称为分子诊断，目前常用的方法有基因诊断和肿瘤标志物检测两种。（一）基因诊断基因诊断是用分子生物学的理论和技术，通过直接探查基因的存在状态或缺陷，从基因结构、定位、复制、转录或翻译水平分析基因的功能，从而对人体状态与疾病作出诊断的方法。基因诊断检测的目标分子是DNA或RNA,反映基因的结构和功能。检测的基因有内源性（即机体口身的基因）和外源性（如病毒、细菌等）网种，前者用于诊断基因有无病变，后者用于诊断有无病原体感染。基因诊

3、断的意义在于不仅能对某些疾病作岀确切诊断，如确定某些遗传病，也能确定基因与疾病有关联的状态，如对疾病的易感性、发病类型和阶段的确定等。就目前已经开展的工作而言，外科领域的遗传性疾病、遗传易感性疾病、多种恶性肿瘤、感染性疾病、器官移植反应等都可以用基因诊断的方法加以诊断。基因诊断的主要技术有核酸分子杂交、聚合酶链反应和生物芯片技术。1.核酸分子杂交技术（1）原理：具有一定互补序列和核昔酸单链在液相或固相中按碱基互补配对原则缔合成异质双链的过程，称为核酸分子杂交。杂交的双方是待测核酸序列和探针序列。应用该技术可对特定DNA或RNA序列进行定性或定量检测。（2）基因探针及其标记：基因探针是一段与待

4、测DNA或RNA互补的核昔酸序列，可以是DNA或RNA,长度不一，可为完整基因，也可为其屮一部分。根据探针的来源和性质分为基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针和人工合成的寡核昔酸探针。作为探针至少必须满足两个条件，一是应为单链（或通过变性形成单链），二是应带有可被示踪和检测的标记。有了合适的探针，就有可能检测出目的基因，观察有无突变，也可根据探针的结合量进行定量检测。选择探针最基本的原则是要有高度特异性，其次也需考虑到制备探针的难易性和检测手段的灵散性等其他因素。(3)常用核酸分了杂交技术：①Southern卬迹杂交；②Northern卬迹朵交；③斑点朵交(dotblotting)；④

5、原位杂交(insituhybridization)；⑤夹心杂交(三明治朵交)；⑥液相杂交。2•聚合酶链反应(即lymerasechainreaction,PCR)⑴原理：PCR是模板DNA,引物和四种脱氧核糖核昔三磷酸(dNTP)在DNA聚合酶作用下发生酶促聚合反应，扩增出所需口的DNAo包括三个基本步骤：双链DNA模板加热变性成单链(变性)；在低温卜•引物与单链DNA互补配对(退火);在适宜温度下TapDNA聚合酶催化引物沿着模板DNA延伸。(2)PCR引物：PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性，引物设计决定PCR反应的成败。由于致病基因是在正常基因序列中发生点突变、片段插

6、人和(或)缺失，基因两翼的DNA序列和正常基因仍然相同，因此根据基因两翼的DNA序列可设计出各20个碱基左右的一对引物。(3)常用PCR技术：利用PCR技术，在适当条件下扩增目的基因，然后分析PCR产物，便可判断其是否为致病基因及其变异性质。PCR技术具有快速、灵散、特异性高等特点，为扩大其应用范围，根据需耍目前已衍行和发展出以下方法:①常规PCR；②复合PCR；③反转录PCR(RT-PCR)；④原位PCR；⑤反向PCR；⑥膜结合PCR；⑦彩色PCR；⑧定量PCR；⑨固着PCR；⑩免疫PCRo3•生物芯片技术是近年发展起来的分子生物学与微电子技术相结合的核酸分析检测技术。最初的生物芯片技术主

7、要冃标是用于DNA序列测定、基因表达谱鉴定和基因突变体检测和分析，所以又称为DNA芯片或基因芯片技术。由于口前这一技术已扩展至免疫反应、受体结合等非核酸领域，出现了蛋口质芯片、免疫芯片、细胞芯片、组织芯片等，所以改称生物芯片技术更符合发展趋势。1)N八芯片技术的基本原理是将cDNA或寡核昔酸探针以105~106位点/C耐的密度结合在固相支持物(即芯片)上，每个位点上的cDNA或寡核昔酸探针的顺序是已知的，将该