基因诊断和基因治疗(80)课件

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1、基因诊断和基因治疗GeneDiagnosisandGeneTherapySectionⅠGeneticDiagnosis基因诊断内源性基因变异基因结构突变基因表达异常外源基因的入侵基因诊断的依据—基因变异:核酸分子杂交（Nucleicacidhybridization）聚合酶链式反应(PCR)单链构象多态性（SSCP）限制性内切酶谱分析法限制性片段长度多态性（RFLP）DNA序列测定（DNAsequencing）生物芯片（biochips）1.核酸分子杂交：在复性过程中，将不同来源的单链DNA分子或RNA分子

2、放在同一溶液中，只要在DNA或RNA的单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，就可以在不同的分子间形成杂化双链，这种现象称为核酸分子杂交。探针技术探针是经过特殊标记的核酸片段，具有特定的序列，能够与待测的核酸片段互补结合，因此可用于检测核酸样品中的同源序列。标记物：同位素、生物素或荧光染料探针种类(广义）：DNA(合成的寡聚核苷酸片段，基因组DNA、cDNA)、RNA、Protein（1）Southern印迹杂交：提取受检者DNA→限制性内切酶消化DNA以产生特定长度的片段→凝胶电泳分离→变性处理DNA成单

3、链→DNA转印到膜上并使其牢固结合→将标记的探针与膜上DNA片段杂交，分析杂交信号。（2）Northern印迹杂交：提取受检者体内mRNA，经变性琼脂糖凝胶电泳后，转移到固相支持物上，通过分子杂交，检测受检者体内特定的mRNA分子的含量与大小。（3）等位基因特异性寡核苷酸(ASO)探针杂交寡核苷酸中的碱基错配会大大影响杂交分子的稳定性，因此可用人工合成的、针对正常和突变等位基因的特异性寡核苷酸探针进行杂交，检测点突变。根据已知基因突变位点的核苷酸序列，人工合成两种寡核苷酸探针：一是相应于突变基因碱基序列的寡核

4、苷酸(M)；二是相应于正常基因碱基序列的寡核苷酸(N)，用它们分别与受检者DNA进行分子杂交。如：载脂蛋白B-100缺陷症的诊断apoB基因编码3500号氨基酸残基的密码子CGGCAG精氨酸谷氨酰胺野生型探针5′-GCACACGGTCTTC(N)突变型探针5′-GCACACAGTCTTC(M)纯合突变：只与M杂交，不与N杂交杂合突变：既与M杂交，又与N杂交无突变：只与N杂交，不与M杂交新类型突变:既不与M杂交，也不与N杂交2.聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR）模板引物dN

5、TPMg2+TaqDNA聚合酶变性延伸退火3.PCR/单链构象多态性分析（PCR-SSCP)（single-strandconformationpolymorphism,SSCP）：相同长度的单链DNA基因碱基序列不同，甚至单个碱基不同，都可能形成不同的空间构象，从而在电泳时泳动速率不同。其他方法还有PCR/ASO法、PCR/限制性酶谱法、PCR/RFLP法。PCR-SSCP分析原理示意22222222222222222222222由于基因的突变使DNA单链的构象发生改变，电泳时其区带位置发生改变，但是具体是

6、哪个碱基发生突变还需要通过测序确定。4.限制性内切酶谱分析法利用限制性内切酶和特异性DNA探针来检测是否存在基因变异。当待测DNA序列中发生突变时会导致某些限制性内切酶位点的改变，其特异的限制性酶切片段在电泳迁移率上也会随之改变，借此可作出分析诊断。如镰状红细胞贫血：β珠蛋白第六个密码子发生单个碱基突变:AT谷缬5.限制性片段长度多态性（RFLP）分析（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）在人类基因组中，平均约200对碱基可发生一对变异（称为中性突变），中性突

7、变导致个体间核苷酸序列的差异，称为DNA多态性。不少DNA多态性发生在限制性内切酶识别位点上，酶解该DNA片段就会产生长度不同的片断，称为限制性片段长度多态性(RFLP)。RFLP按孟德尔方式遗传，在某一特定家族中，如果某一致病基因与特异的多态性片断紧密连锁，就可用这一多态性片段作为一种“遗传标志”，来判断家庭成员或胎儿是否为致病基因的携带者。6.基因芯片技术基因芯片（Genechip/DNAchip）又称为DNA微矩阵，是包被在固相载体上的高密度DNA的微阵列。即将许多特定的DNA片段或cDNA片段作为探针

8、，有规律地紧密排列、固定于单位面积的支持物上。(1)基因芯片的类型：寡核苷酸芯片：采用固相原位合成技术制备的，或用传统方法合成后再固定于芯片上的寡核苷酸探针阵列。DNA微矩阵（DNAMicroarray）：将DNA探针通过自动化点样技术固定于特定的固相支持物如玻璃表面，然后再与靶序列杂交。(2)基因芯片技术的原理DNA芯片技术是将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段有规律地排列、固定于支持物（如膜、硅片