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1、ions.htmlRT—PCR实验心得■提取RNA（我做细胞的）1•取屮号培养瓶（100ml培养瓶注:此时细胞汇合度280%）,用PBS洗细胞两次，弃尽PBS后ill2mlTRIzol（量大无防！），细胞用用吹打管吹至液体澄清且无细胞团块转至2个1.5EP管屮.2.颠倒摇晃10下，室温5分钟.3•在2个EP管中各加入0.2ml氯仿。盖紧样品管盖，用手用力摇晃试管15秒并将其在30°C下孵育2—3分钟。4.在2—8°C下用不超过12,000Xg的离心力高速冷冻离心15分钟。离心后混合物分成三层：下层红色的苯酚■氯仿层，中间层，上层无色的水样层。5.用移液枪分别转上层水相（约500-600（11
2、）于另二个1.5mlEP管中，加等体积异丙醇（约500-600（11）,混匀室温10分钟来沉淀RNA-＞在2—8。（3下以不超过12,000Xg的离心力高速冷冻离心10分钟。注:移液枪的枪头不宜伸入液面太深，以防洗上中层液体!;离心前注意放管的方向，此时RNA沉淀形成一胶状片状沉淀附着于试管壁和管底。6.舍弃上清，用75%的乙醇（用DEPC水处理的，临时十分钟配，预冷保存于4°C或-20°C）1ml来洗涤RNA沉淀一在2—8°C卜•以不超过7,500Xg的离心力高速冷冻离心5分钟。；离心前注意放管的方向，注:旋涡振荡混合样品;RNA在75%乙中，2-8°C至少可保存一周，・20°C至少可保存
3、一年!75%乙（要在抽提时现配）：用无水乙醇和DEPC水配制（DEPC水:无水乙醇=1:3）,然后放于・20°C备用。7弃上清，置于卫生纸上，自然晾干（不能完全干燥），用20-50^11DEPC水溶解。（建议装于0・6的EP管中・）8紫外光度检测注:该步后，可保存于-70°C超低温冰箱，或算好计量建立体系立即用于逆转录.■RT反应体系注意事项1.RT试剂盒屮试剂解冻后，摇晃试管使其均匀，在稍离心，放于冰盒上.反应也在冰上操作.2PCR仪预热到50弋,在放PCR管于PCR仪上（之前在冰上!）开始逆转录3反应体系准备：比原体系大10%;建立25ul的反应体系;先按总反应体系混合总体体系反应物，在
4、分装于PCR管中（分装前宜离心!），再分别加RNA和引物/内参；4R7A的量宜大2ug/reaction!5要有要有逆转录（5（TC,30min）和初始热活化（95°C,15min）；■Reactioncomponentsforone-stepRT-PCRusingQ-Solution（我的一步法）ComponentMastermixRNase-freewater—(provided)5xQIAGENOneStep10.0/5gllxRT-PCRBuffer*dNTPMix(containing102.0/1pl400pMofeachdNTPmMeachdNTP)5xQ-Solution10
5、.0/5
6、illxPrimerA0.6gMtPrimerB0.6gMtQIAGENOneStepx2.0/lpl—RT-PCREnzymeMixTemplateRNA0.5/1pg-1/2
7、ig/reactionTotalvolume50.0/25ul注:引物/内参在反应体系中的浓度为20pM.反应体系要搞清！■PCR反应体系steptimetemperatureReversetranscription30min50°CInitialPCRactivationstep15min95°C3-stepcyclingDenaturationAnncalingExtensionNumberofcyc
8、lesFinalextensionGAPDH:(+)5,-CTGCACCACCAACTGCTTAG-3,；〃G)5'・TGAAGTCAGAGGAGACCACC・3‘扩壇片段长度为407bpGAPDH条件为预变性94°C3min,94°C40s、59度40s、72度1min7个循环，94°C40s、56度40s、72度1min25个循环，72°C延伸5minebcl-2:(+)5,-CGACGACTTCTCCCGCCGCTACCGC-37/(-)5'-CCGCATGCTGGGGCCGTACAGTTCC-3*扩增片段长度为319bp。bcl・2扩增条件为94°C4min,94°C30s、63°C
9、30s、72°C1min,33个循环,72°C7min；bax扩增条件为94°C5min,94°C30s、63°C30s、72°Clmin,94°C1min,31个循环,72°C7mino■电泳1电泳缓冲液：0.5xTBE江作缓冲液0.5xTBE,我的是lOxTBE的浓缩液,100ml的lOxTBE的浓缩液加入1900的三蒸水,既是为0.5TBE.2、6x缓冲液上样缓冲液(4°C保存)■1.0%/1.5%:琼
