RT-PCR实验心得「精编推荐].doc

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1、RT-PCR实验心得提取RNA（我做细胞的）1・取屮号培养瓶（100ml培养瓶注:此吋细胞汇合度$80%）,用PBS洗细胞两次，弃尽PBS后加2mlTRIzol（量大无防！），细胞用用吹打管吹至液体澄清且无细胞团块转至2个1.5EP管中.2•颠倒摇晃10下，室温5分钟.3.在2个EP管屮各加入0.2ml氯仿。盖紧样站管盖，用手用力摇晁试管15秒并将其在30°C下孵育2—3分钟。4•在2—8°C下用不超过12,000Xg的离心力高速冷冻离心15分钟。离心后混合物分成三层：下层红色的苯酚■氯仿层，屮间层，上层无色的水样层。5.用移液枪分别转上层水相（约500-600^

2、1）于另二个1.5mlEP管小，加等体积异内醇（约500-600^1）,混匀室温10分钟來沉淀RNA-＞在2—FC下以不超过12,000Xg的离心力高速冷冻离心10分钊注:移液枪的枪头不宜伸入液面太深，以防洗上中层液体!;离心前注意放管的方向，此吋RNA沉淀形成一胶状片状沉淀附着于试管壁和管底。6.舍弃上清，用75%的乙醇（用DEPC水处理的,临时十分钟配，预冷保存于4°C或-20°C）1ml来洗涤RNA沉淀一在2—8°C下以不超过7,500Xg的离心力高速冷冻离心5分钟。；离心前注意放管的方向，注:旋涡振荡混合样品；RNA在75%乙醇中，2-8°C至少可保存一周

3、，・20°C至少可7弃上清，置于卫牛纸上，自然晾干（不能完全干燥），用20-50plDEPC水溶解。（建议装于0・6的EP管中・）8紫外光度检测注:该步后，可保存于超低温冰箱，或算好计量建立体系立即用于逆转录.■RT反应体系注意事项1.RT试剂盒屮试剂解冻后，摇晃试管使其均匀、在稍离心，放于冰盒丄.反应也在冰上操作.2PCR仪预热到50弋,在放PCR管于PCR仪上（之前在冰上!）开始逆转录.3反应体系准备：比原体系大10%;建立25ul的反应体系;先按总反应体系混合总体体系反应物，在分装于PCR管中（分装前宜离心!），再分别加RNA和引物/内参；step3-ste

4、pcyclingDenaturation4RXA的量宜大2ug/reaction!5要有要有逆转录(50°C,30min)和初始热活化(95°C,15min);■Reactioncomponentsforone-stepRT-PCRusingQ-Solution(我的一步法)ComponentV7olume/reactionFinalconcentrationMastermixRNasc-frccwater—(provided)5xQIAGENOneStep10.0/5pllxRT-PCRBuffer*dNTPMix(containing102.0/1pl400(

5、1MofeachdNTPmMeachdNTP)5xQ-Solution10.0/5pllxPrimerA0.6pMfPrimerB0.6pMfQIAGENOneStepx2.0/Ipl—RT-PCREnzymeMixTemplateRNA0.5/1pg-1/2yg/rcactionTotalvolume50.0/25ul—注:引物/内参在反应体系中的浓度为20nM.反应体系要搞清！■PCR反应体系steptimetemperatureReversetranscription30min50°CInitialPCRactivation15min95°CAnnealin

6、gExtensionNumberofcyclesFinalextensionGAPDH：(+)5,-CTGCACCACCAACTGCTTAG-3,；//(-)5,-TGAAGTCAGAGGAGACCACC-3,扩增片段长度为407bpGAPDH条件为预变性94°C3min,94°C40s、59度40s、72度1min7个循环，94°C40s、56度40s、72度1min25个循环，72°C延伸5minobcl-2:什)5'・CGACGACTTCTCCCGCCGCTACCGC・37/(・)5'・CCGCATGCTGGGGCCGTACAGTTCC-31扩增片段长度为3

7、19bpobcl・2扩增条件为94°C4min,94°C30s、63°C30s、72°Clmin,33个循环,72°C7min；bax扩增条件为94°C5min,94°C30s、63°C30s、72°C1min,94°C1min,31个循环，72°C7min。■电泳1电泳缓冲液：0.5xTBE:I作缓冲液0.5xTBE,我的是lOxTBE的浓缩液，100ml的lOxTBE的浓缩液加入1900的三蒸水,既是为0.5TBE.2、6x缓冲液上样缓冲液（4°C保存）■1.0%/1.5%:琼脂糖凝胶的配制及用法：找干净的容积大约为100ml的瓶子，加琼脂糖0.75g再加50

8、ml电泳缓