rt-pcr实验方法总结

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1、RT-PCR实验方法总结RT-PCR实验有三步:抽提RNA,RT,PCR。要求:1.做RT前必需测RNA浓度,逆转录体系对RNA量还是有一些要求,常用500ng或lugo2.RT按要求做,一般不会出太大问题。3.PCR,按常规。但如需扩长片段,则对前两步要求较高,需要有完整的cDNA存在,不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。1)RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列?必须在RT时,引物设计有3种方法即a:Random9mers;b:OligodT-AdaptorPrimer;和c:特异的下游引物。如果用a和b方法,是扩增的所有的cDNA(理

2、论上),述要用此产物做PCR的模板继续扩增。如果用c方法,那么要去那里查它的序歹U呢?http://www.ncbi.nlm.nih.gov问题:在做RT-PCR遇到一怪现象,即对同一动物不同组织扩增同一段基因,结果从一种组织中可以扩出我的目的基因,条带非常的好,而另一组织在同样的条件下却得到许多非特异性的条带,尝试其他条件同样无法得到满意的结果,百思不得其解!(注:已肯定该基因在两种组织中都表达,且内参照在两种组织都可扩增出来)从这两种组织中提取的RNA的量是不一样的,我测过吸光度,差异还很大,会不会和这有关呢?请高手指教!解答:1.RT-PCR有两种做法:条件

3、具备的话可用kit进行一步法进行;若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。但后来发现两步法的结果更加理想,条带特异性强且无拖尾现象,我推测是体系更加单一比较利于PCR的进行,当然也可能是我买的kit不太好。(promega)。2.RT-PCR应具备的条件:高质量的RNA(保留后可做5爲3?RACE);引物的(最好产物短点);若涉及粗略定量的话还应考虑RNA的浓度或是cDNA的浓度(如果由内标分子更好,但我发现其实很不容易将RNA的浓度以及内标分子的表达量调整的完全一样);体系的均一性等。1.RACE:我做过RACE(3,RACE是宝生物的Kit;5,RACE是

4、Gibico),但现在再进行另一个同源基因的36RACE时却怎么也P不出来,这两个基因是由同一对引物扩增出来的,其中一个已经获得了全序列(RACE的方法),而另一个基因的3PTR却增么也扩不出来,我推测是不是该基因的3PTR太长的缘故,我都快绿了,有无RT-PCR的常用内标b—actin和GAPDH的使用有选择性吗?比如不同的细胞,不同的刺激。有关内参:RT-PCR内参照可以在一个管子里做(那样也是图好看一些),最好分开两管,把除了引物Z外的mixture统一配,拍照后,算目的基因和内参的比值,这就是基因表达的相对浓度。问:我曾经作过同一管的PCR,内有actin

5、和目的基因引物。虽然可见到两条均一条带但图片质量不理想(而且酶量、Mg2+加倍)。请教mxbdna2003,你是如何处理同一管的PCR的各成分的浓度?答:itshoulddeterminedtheamountofRNA.butitnotforthequantitityofthePCR・itjustwasconvienenttoguesstheamountotthetemplate<(fbrRTandPCR)andbettrerforpublicationandeditorifhedonnotknowthepreoceduremuch・buttheamountjus

6、tusing"accuratepiptte11iswrong・itshoudberememberedtodotheinnercontrolofhousekeepinggeneeverytime.在同一管中做RT,其实没有什么问题,不需要taq魅加量,taq酶木来就是过量的,(平时做pci•的时候,完全可以再省一些taq酶的,半斤八两就可以了,我想这肯定再很多贴子里应该都谈到了。Mg就跟不能变了,一变整个体系就变了。能看到均一条带就很好了。关键是摸,十八摸(太少,只争朝夕,开个玩笑)虽然用不着,但是摸上3、5摸总是必要的,首先要分开摸,然后再一起摸,直到摸的好了,还

7、要考虑比较的不同的模板中的量,所以我们不建议再同一管中进行,因为还有互相竞争抑制的问题,即使不同基因之间。有关内参的建议:一定要做内参的,每一次,我想。不作内参的结果是不可信的电泳可以不一起跑,没有关系,计算的是相对表达程度,着我在好几封帖子里都谈了,再说一边我得观点,1、半定量和定量RT-PCR做的都是基因相对表达量,不是绝对表达量,除非你能准确知道来自多少细胞,但是细胞还有死的呢。2、以电泳为基础的半定量RT-PCR本身是不可信的,作为实验的粗筛是可以的,但不能作为最终结果的,3、半定量RT-PCR应该再两管中进行,除非内参基因和目的基因表达相同,长度差不多,

8、GC含量相

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