rt-pcr实验方法总结

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1、RT-PCR实验方法总结RT-PCR实验有三步：抽提RNA,RT,PCR。要求：1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或lugo2.RT按要求做，一般不会出太大问题。3.PCR,按常规。但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。1）RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？必须在RT时，引物设计有3种方法即a：Random9mers；b：OligodT-AdaptorPrimer；和c：特异的下游引物。如果用a和b方法，是扩增的所有的cDNA（理

2、论上），述要用此产物做PCR的模板继续扩增。如果用c方法，那么要去那里查它的序歹U呢？http://www.ncbi.nlm.nih.gov问题：在做RT-PCR遇到一怪现象，即对同一动物不同组织扩增同一段基因，结果从一种组织中可以扩出我的目的基因，条带非常的好，而另一组织在同样的条件下却得到许多非特异性的条带，尝试其他条件同样无法得到满意的结果，百思不得其解！（注：已肯定该基因在两种组织中都表达，且内参照在两种组织都可扩增出来）从这两种组织中提取的RNA的量是不一样的，我测过吸光度，差异还很大,会不会和这有关呢？请高手指教！解答：1.RT-PCR有两种做法：条件

3、具备的话可用kit进行一步法进行；若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。但后来发现两步法的结果更加理想，条带特异性强且无拖尾现象，我推测是体系更加单一比较利于PCR的进行，当然也可能是我买的kit不太好。（promega）。2.RT-PCR应具备的条件：高质量的RNA（保留后可做5爲3?RACE）；引物的（最好产物短点）；若涉及粗略定量的话还应考虑RNA的浓度或是cDNA的浓度（如果由内标分子更好，但我发现其实很不容易将RNA的浓度以及内标分子的表达量调整的完全一样）；体系的均一性等。1.RACE：我做过RACE（3,RACE是宝生物的Kit；5,RACE是

4、Gibico）,但现在再进行另一个同源基因的36RACE时却怎么也P不出来，这两个基因是由同一对引物扩增出来的，其中一个已经获得了全序列（RACE的方法），而另一个基因的3PTR却增么也扩不出来，我推测是不是该基因的3PTR太长的缘故，我都快绿了，有无RT-PCR的常用内标b—actin和GAPDH的使用有选择性吗？比如不同的细胞，不同的刺激。有关内参：RT-PCR内参照可以在一个管子里做（那样也是图好看一些）,最好分开两管，把除了引物Z外的mixture统一配，拍照后，算目的基因和内参的比值，这就是基因表达的相对浓度。问：我曾经作过同一管的PCR,内有actin

5、和目的基因引物。虽然可见到两条均一条带但图片质量不理想（而且酶量、Mg2+加倍）。请教mxbdna2003,你是如何处理同一管的PCR的各成分的浓度？答：itshoulddeterminedtheamountofRNA.butitnotforthequantitityofthePCR・itjustwasconvienenttoguesstheamountotthetemplate＜（fbrRTandPCR）andbettrerforpublicationandeditorifhedonnotknowthepreoceduremuch・buttheamountjus

6、tusing"accuratepiptte11iswrong・itshoudberememberedtodotheinnercontrolofhousekeepinggeneeverytime.在同一管中做RT,其实没有什么问题，不需要taq魅加量，taq酶木来就是过量的，（平时做pci•的时候，完全可以再省一些taq酶的，半斤八两就可以了，我想这肯定再很多贴子里应该都谈到了。Mg就跟不能变了，一变整个体系就变了。能看到均一条带就很好了。关键是摸，十八摸（太少，只争朝夕，开个玩笑）虽然用不着，但是摸上3、5摸总是必要的，首先要分开摸，然后再一起摸，直到摸的好了，还

7、要考虑比较的不同的模板中的量，所以我们不建议再同一管中进行,因为还有互相竞争抑制的问题，即使不同基因之间。有关内参的建议：一定要做内参的，每一次，我想。不作内参的结果是不可信的电泳可以不一起跑，没有关系，计算的是相对表达程度，着我在好几封帖子里都谈了，再说一边我得观点，1、半定量和定量RT-PCR做的都是基因相对表达量,不是绝对表达量，除非你能准确知道来自多少细胞，但是细胞还有死的呢。2、以电泳为基础的半定量RT-PCR本身是不可信的，作为实验的粗筛是可以的，但不能作为最终结果的，3、半定量RT-PCR应该再两管中进行，除非内参基因和目的基因表达相同，长度差不多，

8、GC含量相