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《厚壳贻贝抗菌肽的真核表达【开题报告】》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、毕业论文开题报告生物科学厚壳贻贝抗菌肽的真核表达一、论述厚壳贻贝抗菌肽的研究现状，说明选题的依据和意义贻贝是一类具有重要经济价值的海洋生物，它生存于富含各种微生物的水环境中，同时其本身不存在一个类似于高等动物的特异的免疫系统，长期的生存适应使贻贝发展了一套有效的防御系统，即自身能够产生大量抗菌肽，用以抵抗外来微生物的侵袭。贻贝抗菌肽因其高效、广谱的抗菌活性而成为海洋生物抗菌肽研究中的一个关注对象。贻贝抗菌肽是一类小分子的阳离子抗菌肽。以富含半胱氨酸为特征。Mitta等[1]从两种贻贝(Mytiluseduli
2、s、Mytilusgalloprovincialis)中分离到多种抗菌肽,根据它们一级结构和半胱氨酸的不同分为4组:defensin,mytilin,myticin和mytimycin。在贻贝中有两种同分异构体,分别命为MGD1、MGD2。MGD1在蓝贻贝(Mytilusedulis)和地中海贻贝(Mytilusgalloprovin-cialis)血液中均能分离到[2~4]第2种同分异构体命名为MGD2,是在贻贝血细胞cDNA文库中分离得到的。MGD2一共含有8个半胱氨酸,是防御素家族的特殊成员。经核磁共振
3、分析MGD1的三维结构为高度压缩结构,主要由规范的Csаβ膜序结构组成(Cys4-Cys25、Cys10-Cys33、Cys14-Cys35、Cys21-Cys38)4个二硫桥[5]。第2组为mytilin,包括5个同分异构体(A、B、C、D、G1)。同分异构体A和B是在蓝贻贝的血液中分离到的[3]。B、C、D、G1是从地中海贻贝的血液中分离得到的[6]。MytilinA和mytilinB分别含有37个氨基酸和35个氨基酸,其中均有6个半胱氨酸存在。第3组为myticin,包括myticinA和myticin
4、B,是从地中海贻贝的血液中分离到的[6]。序列分析证实myticinA和myticinB有共同的结构,20个信号肽高度保守,40个氨基酸序列中C端的36个氨基酸序列一致。两种抗菌肽的结构中有2个氨基酸不同,myticinA的第4和第9序列的I和L分别在myticinB中被M和V取代。第4组为mytimycin,是一种从贻贝血浆中分离到的含有12个半胱氨酸,分子量为6.5kD的抗真菌32肽[3]。mytilin和myticin的结构独特,在蛋白质的数据库中为首次报道[7]。研究发现，抗菌肽产量低，天然分离难度大
5、，且化学合成成本高。因此，设计并改造已存在的天然抗菌肽基因，通过基因克隆手段将目的基因克隆至表达载体，通过基因表达从而获取大量的抗菌肽进行深入研究是目前抗菌肽研究的一个方向。厚壳贻贝是一种常见的海洋生物，属于软体动物门，双壳纲，翼形亚纲，贻贝目，是浙江省重要的经济养殖贝类。目前，对厚壳贻贝抗菌肽mytilin的研究尚不多见，为进一步研究厚壳贻贝抗菌肽mytilin家族的cDNA基因序列及其分子多样性机制，本课题通过设计特异性引物，从厚壳贻贝血细胞cDNA文库中筛选目的抗菌肽mytilin基因，对其基因结构进行
6、研究和分析,从而构建高效真核表达载体，期望通过基因工程手段使mytilin抗菌肽在体外大量表达，进而研究其功能和抗菌机理。二、研究的基本内容，拟解决的主要问题：研究的基本内容：1厚壳贻贝抗菌肽Mytilin基因的克隆；2厚壳贻贝抗菌肽Mytilin真核表达载体的构建；解决的主要问题：1.厚壳贻贝抗菌肽Mytilin基因的基因克隆技术；2.厚壳贻贝抗菌肽Mytilin基因真核表达载体的构建和体外表达技术；三、研究步骤、方法及措施：研究步骤：研究步骤：一、厚壳贻贝抗菌肽Mytilin基因的克隆1.查阅相关资料,做
7、好笔记；2.仔细阅读研究文献资料并翻译相关英文资料；3.设计mytilin特异性引物，以cDNA文库为模板，进行PCR，通过琼脂糖凝胶电泳鉴定克隆片段大小。4胶回收目的片段，与pMD19-T载体连接，转化至E.coli感受态细胞，进行蓝白斑筛选阳性单克隆。5.挑选白斑克隆进行菌落PCR鉴定；6.阳性克隆送生物公司测序。二、厚壳贻贝抗菌肽Mytilin基因真核表达载体的构建和体外表达1.根据上述所获得的mytilin基因的成熟肽序列设计引物（引物需包含保护碱基，双酶切位点），后续基因克隆手段与上同，克隆成功后，
8、双酶切目的片段和载体pVT102U/ａ，连接后转入酵母S78进行表达；8.重组抗菌肽mytilin的纯化和验证；9.撰写论文。四、参考文献[1] MittaG,VandenbulckeF,HubertF,etal.Involvementofmytilinsinmusselantimicrobialdefense[J].JBiolChem,2000,275:12954[2] vonBubnoffA.S
