第六章 克隆基因的表达

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1、第六章克隆基因的表达遗传信息从DNA到蛋白质的传递过程——中心法则（centraldogma）。（一）、基因表达：（二）克隆基因的表达：外源基因在宿主细胞中表达。外源基因表达载体重组载体导入宿主细胞在宿主细胞中表达出蛋白质提取蛋白宿主细胞：原核细胞或真核细胞。一、外源基因表达机制P169（一）外源基因的起始转录启动子和相关调控序列的作用增强子衰减子等（二）mRNA的延伸与稳定性mRNA有效延伸、终止、稳定性是表达关键。Prok.：终止子结构：（不）依赖ρ；避免提前终止：衰减子；RNase缺失受体菌Eur.：poly(A)掺入位点AAUAA；加工成熟mRNA（四）表达蛋白在细胞中的稳定性构

2、建融合蛋白表达系统、构建分泌蛋白表达系统、构建包涵体表达系统、选择蛋白水解酶基因缺陷型的受体系统.（三）外源基因mRNA的有效翻译Prok.:SD序列，起始密码子，SD与密码子的距离等Euk.:5’cap,扫描序列GCC（A/G）CCAUGG,有效的ORF。密码子使用频率。（五）目的基因沉默（genesilencing）导入并整合到受体细胞核基因组上的外源基因，在当代或后代转基因个体中表达活性受到抑制的现象。位置效应基因沉默：甲基化、异染色质区等转录水平的基因沉默：启动子甲基化、基因异染色质化转录后水平的基因沉默（PTGS）二、外源基因表达系统P161原核基因表达系统：大肠杆菌基因表达系

3、统芽孢杆菌基因表达系统真核基因表达系统：酵母基因表达系统昆虫基因表达系统植物细胞基因表达系统动物细胞基因表达系统原核基因表达系统（大肠杆菌中表达系统）（一）原核生物基因表达的特点P1531、原核生物只有一种RNA聚合酶，识别原核细胞的启动子。表达调控主要在转录水平。5、mRNA5’端有SD序列，是mRNA结合到核糖体上必需的。2、基因的表达是以操纵子为单位进行协同表达。3、原核生物转录和翻译是偶联的。4、基因不含内含子，真核生物mRNA在原核生物中表达不能成熟。（二）大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征P1611、大肠杆菌表达外源基因的优势（1）遗传背景清楚。全基因组测序，基因组结构简单

4、，便于基因操作和分析。（2）多数细胞内有质粒或噬菌体，便于构建相应表达载体，目标基因表达水平高。（3）代谢途径和基因表达调控机制比较清楚（4）繁殖迅速、培养简单、操作方便（5）被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物2、大肠杆菌表达外源基因的劣势（1）缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统（2）内源性蛋白酶降解异源蛋白（三）外源基因在大肠杆菌中表达的原理启动子终止子核糖体结合位点密码子质粒拷贝数表达载体的必要元件1、启动子TTGACAsextamaboxTATAATTGTACA①必须是一种强启动子能使外源基因的蛋白产量达到细胞总蛋白的10%-30%以上。②应是可诱导型的便于表达毒性蛋白等。③

5、应呈现低水平的基础转录用温度或化学试剂诱导。（1）最佳启动子必须具备的条件常用启动子：乳糖启动子Plac的可控性：乳糖启动子均为抗葡萄糖代谢阻遏的突变型，即PlacUV5（2）乳糖启动子lac（Lac表达系统）P164CAP色氨酸启动子Ptrp受色氨酸-阻遏蛋白复合物阻遏，转录呈基底状态。（3）色氨酸启动子trp（Trp表达系统）IAA与Trp结构相似，可以与阻遏蛋白结合。通过添加IAA可诱导Ptrp介导的目的基因的表达。cI857:调节基因cI：选择一个温度敏感性的突变基因cI857，克隆到载体上。42oC时阻遏蛋白失活，外源基因大量转录cI857PL外源基因30oC时阻遏PL，外源基

6、因不转录。（4）PL和PR启动子（PL和PR表达系统）从噬菌体得到的一类启动子,PL、PR是否转录与CI基因产物有关，决定了噬菌体是进入溶源循环还是溶菌循环。2、终止子（terminator)P163RNA聚合酶滑过终止子继续转录质粒上邻近DNA序列，形成长短不一的mRNA混合物。常用：来自大肠杆菌rRNA操纵子上的rrnT1T2串联终止子和T7噬菌体DNA上的TΦ强终止子保证载体不会转录非必须基因，不必浪费源料和能量、不干扰正常的表达。3、核糖体结合位点（RBS）大肠杆菌中，翻译起始时，首先是核糖体小亚基（30S）识别和结合到mRNA5’端的翻译起始部位，该顺序称为核糖体结合位点（r

7、ibosomebindingsite,RBS）四个特征要素：SD序列、翻译起始密码子、SD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成、基因编码区5’端若干密码子的碱基序列。SD序列：位于翻译起始密码子上游的5-13个核苷酸序列5’UAAGGAGG3’。5’-AGGAGGU-3’？？？？S-D序列后面的4个碱基：如是A（U）,翻译效率最高；如是G（C）,效率只有50%或25%。核糖体结合位点对外源基因表达的影响SD序列与起始密码子之间的