六、克隆基因的表达

《六、克隆基因的表达》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、GeneticEngineering1.基因工程概述2.基因工程的基础知识与基本技术3.基因工程所需基本条件4.基因工程的操作过程5.目的基因的获取6.克隆基因的表达7.转基因生物技术6.克隆基因的表达外源基因在原核细胞中的表达外源基因在真核细胞中的表达------酵母菌、昆虫细胞、植物原生质体、动物培养细胞遗传信息从DNA到蛋白质的传递过程——中心法则（centraldogma）。基因表达：克隆基因的表达：外源基因在宿主细胞中表达。外源基因表达载体重组载体导入宿主细胞在宿主细胞中表达出蛋白质提取蛋白宿主细胞：原核细胞或

2、真核细胞。AdividingE.coli第一节外源基因在原核细胞中的表达原核或噬菌体启动子MCSSD序列终止子识别原核细胞的启动子，催化所有的RNA合成。数个相关的结构基因与其调控区结合形成一个表达的协同单位。一、原核生物基因表达的特点2.以操纵子为单位1.只有一种RNA多聚酶有意义链5’反意义链3’转录mRNA5’3’翻译蛋白质NC5’3’3.转录和翻译偶联、连续进行。4.不含内含子，缺乏转录后的加工系统。5.调控主要在转录水平上。同核糖体16SRNA3’末端碱基互补的序列，叫Shine-Dalgarno（S-D）序列

3、︰5’AGGAGG3’。6.mRNA的核糖体结合位点Shine-Dalgarno（S-D）sequence:二、原核表达系统的注意事项外源基因不能带有内含子。2.不能直接用真核基因组DNA,必须用cDNA3.必须利用原核细胞的调控原件（启动子等）4.防止外源基因产物对宿主细胞的毒害。是DNA上的能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。具序列特异性、方向性、位置特异性、种属特异性。大肠杆菌的所有启动子中都有两段一致顺序（consensussequence）。三、原核生物基因表达的调控1.启动子-35Box和-10B

4、ox（1）启动子序列consensussequencesSextama框5’-TTGACA-3’5’-TATAAT-3’②-10box（PribnowBox）TTGACATATAAT转录起始位点17bp5’核糖体结合位点RNA聚合酶亚基的识别位点。①-35box原核启动子共有序列的功能（2）翻译的起始位点①核糖体结合位点（RBS）Shine-Dalgarno（SD）sequence：mRNA上与核糖体16sRNA结合的序列。ribosomebindingsiteSDmRNA5’—AGGAGGU——AUG——16SrRN

5、A3’UCCUCCAAUG（91%）GUG（8%）UUG（1%）位于SD序列下游。②起始密码：SD序列距离AUG的距离，最佳7bp;SD序列与核糖体16SrRNA3’碱基的互补性；SD序列与AUG之间的碱基组成也很重要，AAAA、GGGG时效率最高SD序列影响翻译效率：全酶是一个5聚体，含有两个α小亚基，和2两个大亚基（β和β′），一个σ亚基。2.RNA多聚酶大肠杆菌只有一种类型的RNA多聚酶转录tRNA，rRNA和mRNA。（1）结构3.转录终止子内终止子intrinsicterminator：E.coli中促使转录终

6、止的DNA位置有一段反向回文顺序，其后紧接一串U，称为内终止子，或本征终止子，形成终止信号。不需要其他蛋白辅助因子参与在表达载体克隆位点的下游一般设计一段转录终止子。启动子操纵子S-D序列目的基因终止子由于茎环3’段紧接一串A/U的配对，稳定性比较差，有利于转录物脱落而不利于转录延续。原因：反向回文顺序被转录后，立即形成一个茎环结构，使转录物与模板之间配对的碱基数降低，整个减弱了RNA与DNA的互作①茎环结构②多聚A/U5-CCCACAGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTAACTTCTTTCT-33-GG

7、GTGTCGGCGGTCAAGGCGACCGCCGTAAAATTGAAGAAAGA-5(模板)转录↓5-CCCACAGCCGCCAGUUCCGCUGGCGGCAUUUU-OH-3(RNA)RNA折叠↓mRNA折叠UCCUGG—CA—UC—GC—GG—CC—GC—GG—CAACCCACUUUU—3DNARNA聚合酶脱落大肠杆菌偏爱UAAU。一般安置上全部的三个终止密码防止核糖体跳跃（skipping）。Translationenhancer能够显著增强启动子转录活性的DNA序列，由多个元件组成，每一元件可与一种或多种转录调

8、控因子结合。具双向性、特异性，其发挥功能与所处位置无关。4.翻译终止密码5.翻译增强子①必须是一种强启动子能使外源基因的蛋白产量达到细胞总蛋白的10%-30%以上。②应呈现低水平的基础转录便于表达毒性蛋白等。③应是可诱导型的用温度或化学试剂诱导。（1）最佳启动子必须具备的条件基因工程常用的原核启动子来自大肠杆菌的乳糖