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1、实验单元6：基因克隆学号No・：姓名Name：日期Date：2014,04,26摘要：基因克隆是在体外将目的基因（或其它有意义的DNA片段）同能够自我复制的载体DNA连接，然后将其转入宿主细胞或受体生物进行表达或进一步研究。通过PCR法扩增目的基因片断的过程屮，由于往往不清楚目的基因的DNA序列，获得的目的片断通常需要通过TA克隆的方法，重组到T•载体中，通过序列测定清楚DNA序列。本实验应用RT-PCR技术从团头鲂肝脏RNA中扩增B-actin基因cDNA片段，并克隆到质粒载体pMD18-T,鉴定测序。结
2、果显示：只有少数组别成功克隆出廿的基因片段。关键词：基因克隆；T・A克隆；
3、才
4、头鲂；3-actin基因一、前言对PCR产物进行克隆是分子生物领域以及基因工程领域中常用的方法，随着PCR方法应用的多元化，PCR产物的克隆显得尤为重要。以前对PCR产物进行克隆实验，采用的方案大概有以下儿种：一是用Klenow酶或单链核酸酶（如S1核酸酶或绿豆核酸酶）将PCR产物的两端切成平末端，然后克隆到也切成平端的质粒载体上，或在PCR产物的两端加上人工接头（Linker）,经过限制性内切酶处理以后，再克隆到用相应限制性内
5、切酶酶切产生的载体上；二是在设计PCR产物吋，在引物的）!端引入特异性的内切酶识别序列，在PCR反应结束后,将PCR产物用相应的限制性内切酶进行处理，使之两端产生粘性末端，以便于克隆到载体的相应酶切位点上［1］。这两种方法都很烦琐，第一种方法的克隆效率很低，第二种方法在进行酶切处理时，如果PCR产物本身含有相应的酶切位点时，则冇口J能切断PCR产物。近年来发展了几种PCR产物的直接克隆方法，一种是T4DNA聚合酶补平,另一种是T・A克隆法。其中，T・A克隆法不仅操作简便，而且大大提高了克隆效率，已经成为克隆
6、PCR产物的主要方法之一。但是，在采用T・A克隆法时，随着插入片段长度的增加，克隆效率明显下降，尤其是当PCR产物长度大于3000bp时,其克隆效率甚至会低于平末端的克隆效率。有的学者针对不同长度的PCR产物尝试了不同的T-A克隆法，并11对其克隆效率进行了比较，对不同长度的PCR产物提出了相对优化的克隆法。结果表明，对于较短的PCR产物500bp左右），采用常规的T-A克隆法即可得到较高的克隆效率；对于中等长度的PCR产物（3000bp左右），用温度循环T・A克隆法可获得较高的克隆效率；对于较长的PCR产
7、物（6000bp左右），用二次重组T・A克隆法可以提高克隆效率［2］。二、材料与方法2.1材料实验材料:新鲜的团头鲂肝脏、TrizoL氯仿、异丙醇、75%酒精（用DEPC水和无水乙醇配制）、DEPC水、琼脂糖、LoadingBuffer＞无RNA酶的枪头（ImL、200uL、10uL）、无RNA®的1.5mL离心管、（ln）L、200uL、lOuL）移液枪、反转录酶、RNA酶抑制剂、oligo引物、反转录buffer、10mmol/LdNTP、无RNA酶的10uLPCR管、无菌水、buffer＞正向和反向引
8、物、模板、rTaq、dNTP、无菌10ULPCR管、DNA纯化试剂盒、pMD18-T＞感受态细胞、LB液体培养基（含氨茉和不含氨茉）、无菌枪头（ImL、200uL、10uL）、无菌0.5mL离心管2.2方法实验流程新鲜肝脏组织mRNAcDNAPCR的基因片段放大序列分析2.2.1RNA提取（1）先向玻璃匀浆器中加ImLTrizol并放在冰上预冷,取约30-100mg新鲜组织至匀浆器屮，迅速匀浆至无可见组织块。将匀浆液转移至2ml离心管屮，室温静置5min。(2)向离心管中加入200〜300
9、1L氯仿(约为R
10、NAiso的1/5体积量)，振荡混匀至液体不粘稠。室温静置5-15mine(3)12,000g,4°C离心15mine(4)吸取上清液至1.5ml离心管中,加入0.5ml异丙醇,颠倒数下混匀,室温静置5・10分钟。(5)12,000g,4°C离心8min,弃上清。(6)加入1ml75%乙醇，轻微振荡数下，12,000g,4°C离心5min,弃上清。(7)用75%乙醇重复洗涤一次(可选)。(8)室温干燥3-5min(不能完全干燥)。加入20〜50ulDEPC水溶解，电泳检测。2.2.2反转录PCR1)总RNA
11、5(1L+DEPC水补充到11
12、1L2)20gmol/LPoly(T)引物1gL3)稍离心后使溶液到管底后，在PCR仪上68°C孵育10min,立即将PCR管插入冰中，放置2—5min4)继续加入以下组分：4
13、iL2pL1yL(40u)1
14、1L(200u)短暂离心后42°CPCR仪中反应1ho反应结M-MLV5xReactionBuffer10mmol/LdNTPRNasinRibonucleaseInhibit
