基因克隆-4基因剔除

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1、GenesmRNAsProteinsLoss-of-FunctionPhenotypesToolsforFunctionalAnalysis•Knockouts•DominantNegative(显型负突变)•Antibodies•Aptamers(寡核苷酸适配子)•Antisense•Ribozymes•siRNAsDemonstrationofacasualroleofageneintheinitiation,maintenance,ormodulationofaphenotypebyselectivedecrease(knockdown)orlack(knockout)ofgenefun

2、ction.GeneofInterestGainofFunctionLossofFunction六、基因剔除技术（一）基因剔除技术的概念基因剔除（geneknockout）或基因靶向(genetargeting)灭活是将生物体中某一特定的基因功能给破坏，再研究当生物体缺少这个基因在生长发育的过成中会有怎样的改变，或是会好发怎样的疾病。原理：利用细胞复制分裂时，染色体进行联合互换发生同源重组homologousrecombination）Prdx1geneEScell胚胎杂合子Prdx+/-纯合子Prdx-/-Prdx1+/+:widetypemice(N=34)Prdx1+/-：Prdx1he

3、teroxygousmice(N=88)Prdx1-/-：Prdx1knockoutmice(N=64)Sourthernblot-DNANothernblot-RNAGenerationofPrdx1-/-mice进入多重防护的SPF动物室检查受精母鼠取胚胚显微注射DNA显微注射显微注射完成胚植入输卵管养殖小鼠动物饲养（二）基因剔除技术的应用★阐明特定基因功能、基因间相互作用★阐明基因结构与功能异常在疾病发生、演进和归转中的作用，即疾病分子调控机制★在精确的时间、组织打开或关闭特定基因★可对基因进行单个碱基或大片段的修饰★确定药物作用的分子靶点，有效筛选新药ModelOrganismsUse

4、dinFunctionalGenomicsMajorEventsintheDevelopmentofGeneTargeting骨保护蛋白(Osteoprotegerin,OPG)+/+-/-转基因鼠基因剔除鼠骨硬化骨质疏松症ProcedureofKnockoutMice七、RNA干扰技术（一）RNA干扰技术的概念生物体内，双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)，能识别含有其互补序列的mRNA并与之结合，在酶的作用下降解mRNA，从而干扰相应基因表达。这一现象称为RNA干扰(RNAinterference，RNAi)。RNAi在生物抵御病毒感染、维持基因组中转座子的稳定以

5、及某些生物生殖细胞的发育过程中都起着重要作用。（细胞膜）（细胞核）（细胞质）基因的表达转录翻译（转运RNA）（核糖体RNA）RNAi现象的发现1995年，康奈尔大学的研究人员Guo和Kemphues尝试用反义RNA去阻断par-1基因的表达以探讨该基因的功能，结果反义RNA的确能够阻断par-1基因的表达，但是奇怪的是，注入正义链RNA作为对照，也同样阻断了该基因的表达。GuoS,KemphuesKJ.par-1,agenerequiredforestablishingpolarityinC.elegansembryos,encodesaputativeSer/Thrkinasethatisa

6、symmetricallydistributed.Cell.1995;81(4):611-20.SectionofGeneticsandDevelopment,CornellUniversity,Ithaca,NewYork14853,USA.基因沉默，即性状不表现外源导入或者转基因表达反义RNA，抑制rRNA和tRNA的翻译。Fire等(1998)发现将dsRNA注入线虫体内后可抑制序列同源基因的表达,并证实这种抑制主要作用于转录之后，所以又称转录后基因沉默(posttranscriptionalgenesilencing,PTGS)。该课题组将这一现象称为RNA干扰（RNAinterfer

7、ence，简称RNAi）。FireA,etal.Potentandspecificgeneticinterferencebydouble-strandedRNAinC.elegans.Nature.1998;391(6669):806-11.（二）RNA干扰技术的原理（3步骤）dsRNA的形成siRNA的形成RNAi的形成靶基因mRNAsiRNA的反义链RNAi是生物体抵御外源遗传物质入侵的自我保