《基因克隆》课件

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1、现代分子生物学大实验第一模块基因克隆技术凝胶回收或纯化目的基因序列测定质粒提取连接产物的转化目的基因插入载体植物体植物总RNA（DNA）凝胶电泳ATTART-PCR合成目的基因基因克隆实验流程PCR合成目的基因实验内容实验一聚合酶链式反应（PCR）及琼脂糖凝胶电泳检测DNA实验二特异扩增片段的回收纯化、连接、转化及质粒DNA的提取实验一聚合酶链式反应技术（PCR）PolymeraseChainReaction琼脂糖凝胶电泳检测DNA实验目的学习和掌握PCR扩增的原理和操作方法了解扩增过程中各因素对扩增结果的影响深刻理解PCR基因扩

2、增技术在DNA操作中的重要性对含有目的基因的质粒进行PCR验证。琼脂糖凝胶分离DNA的原理琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术多聚酶链式反应(polymerasechainreaction)简称PCR技术，是80年代中期发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的技术。此法操作简便，可在短时间内在试管中获得数百万个特异的目的DNA序列的拷贝。PCR技术实际上是在模板DNA(template)，引物(primer)和４种脱氧核苷酸(dNTP)存在的条件下依赖于DNA聚合酶(Taq)的酶促合反应，PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。

3、反应分三步：变性（denaturation）；退火（annealing）；延伸（extension）PCR简介PCR的应用PCR操作简便、省时、灵敏度高、对原始材料的质和量要求低。因此，广泛应用于许多领域。基因克隆及定量、扩增特异性片段用于探针、体外获得突变体、提供大量DNA用于测序等；遗传病的产前诊断；致病病原体的检测；癌基因的检测和诊断；DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别及法医物证；动、植物检疫；在转基因动植物中检查植入基因的存在。实验原理在高温（93-95℃）下，DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温（37～65℃）情况

4、下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在Taq酶的最适温度（72℃）下，以引物3’端为合成的起点，以单核苷酸（dNTP)为原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新链。每一双链的DNA模板，经过一次变性（解链）、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的指数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106

5、～107倍。实验仪器及试剂PCR仪、掌型离心机、微量移液器、冰盒、Tip头、离心管模板,Primer,10XPCRbuffer,dNTPMixture,Taq酶,H2O操作步骤取PCR管，标明管号按体积配置PCR反应体系（冰上操作)轻弹管壁，混匀，掌型离心机甩至管底，立即反应反应体系ddWater12ul10XPCRbuffer2.0ul+2.0ulMg+dNTPMixture2.0ulPrimerF0.4ulPrimerR0.4ulplasmid(1-50ng)1.0ulTaq酶0.2ulTotal20ulPCR反应程序94℃3min94

6、℃30sec59℃30sec72℃30sec72℃7min10℃∞30cycles引物扩增模板DNA，首先要设计两条寡核苷酸引物,实际上就是两段与待扩增靶DNA序列互补的寡核苷酸片段，两引物间距离决定扩增片段的长度，两引物的5’端决定扩增产物的两个5’末端位置。由于引物是决定PCR扩增片段长度、位置和结果的关键，因此，引物设计也就更为重要。PrimerIPrimerIIAmplifiedtargetfragment长度一般最低不少于16个核苷酸，而最高不超过30个核苷酸，最佳长度为20－24个核苷酸。有时可在5’端添加不与模板互补的序列，如

7、限制性酶切位点或增强因子等，以完成基因克隆和其它特殊需要，但要在酶切位点的5‘端加上额外的3－4个核苷酸，以确保附加的酶切位点有效。两个引物之间不应发生互补，特别是在引物3’端，即使无法避免，其3’端互补碱基也不应大于2个碱基，否则易生成“引物二聚体”（Primerdimer）。引物内部应避免内部形成明显的次级结构，尤其是发夹结构（hairpinstructures）。(G+C）%含量引物的组成应均匀，尽量避免含有相同的碱基多聚体。两个引物中（G+C）%含量应尽量相似。引物的设计一般在0.1－1μM之间。浓度过高易形成引物二聚体且产生非特异

8、性产物。一般来说用低浓度引物经济、特异，但浓度过低，不足以完成30个循环的扩增反应，则会降低PCR的产率。引物在PCR反应中的浓度引物退火一般可根据引物的（G+C）%含量进行推测