《基因的克隆》PPT课件

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1、基因的克隆基因工程基因的克隆-----ＤＮＡ重组技术。克隆：是用无性繁殖的方法产生一组遗传上相同的细胞或生物群体的过程，而这些细胞或个体均来自无性繁殖的单一原型细胞。基因的克隆:用ＤＮＡ重组技术使一个基因或ＤＮＡ片段产生出很多相同拷贝的过程。目的基因的表达连接产物导入受体细胞目的基因与载体连接获取目的基因得出结论步骤三：步骤二：步骤一：基因克隆的技术路线的大体步骤一、获取目的基因从染色体中获得目的基因1.基因组DNA的随机断裂片段2.限制性内切酶切割基因组DNA3.用反转录法合成cDNA人工合成PCR扩增特定的目的基因片段基因克隆的载体载体满足的几个要求：1.分子相对较小（3

2、～10Kb）能进行复制且具有高度拷贝数2.具有几个单一的酶切位点，便于所要DNA片段能够连接、插入载体，酶切位点应该在载体复制子意外适当的位置。3.外源性DNA插入后，载体在受体细胞中的复制不受影响。4.载体本身应对受体细胞无害，以及能接纳尽可能大的外源性DNA片段。5.有便于筛选的明显标志，以便于阳性克隆细胞容易被选出6.具有促进外源性DNA表达的调控区。7.生物防护安全，不污染环境。载体的种类质粒1.大肠杆菌质粒2.革兰氏阳性菌的质粒噬菌体真核细胞为宿主的克隆载体1.酵母为宿主的载体2.植物细胞为宿主的载体3.DNA病毒载体反转录病毒载体大肠杆菌的质粒pBR322质粒：它

3、是由4361个核苷酸组成，属于松弛型质粒，可以用抗氨苄西林和抗四环素基因作为标记，具有多种常用内切酶的切点。pBR322克隆DNA片段的程序质粒作为基因克隆载体应注意：质粒的选择：质粒应具备完成实验目的所需的基本结构，如启动子、ＳＤ顺序、终止信号、分泌信号等。其次是质粒DNA上应具备能满足重组用的内切酶位点。酶切DNA片段末端的考虑：酶切后形成的DNA片段末端有黏性末端和平末端。在插入片段和载体片段末端之间连接时会出现：两个不同黏性末端的连接和两个相同黏性末端连接；一个黏性一个平末端和两个平末端连接。载体的自身环化：有时发生酶切过的线性载体DNA在酶的（T4DNA）催化下，线

4、性载体DNA两黏性末端会重新连接。可以通过调整插入片段与载体之间的浓度，在一定程度上可以减少这种现象。也可以通过磷酸酯酶处理线性载体DNA。以植物细胞为宿主的基因克隆载体主要应用Ti质粒（根瘤土壤农杆菌），由于Ti质粒的宿主广泛，其T-DNA可以整合到植物细胞中，同时冠瘿氨基酸合成酶基因启动子能整合到染色体中，因此Ti质粒作为基因工程的载体：1.在体外将从Ti质粒中切割下的T-DNA插入到另一种质粒中，再用内切酶切开T-DNA，在T-DNA片段中冠瘿氨基酸合成酶启动子下游处插入外源性基因形成重组子。2.分别用野生型ti质粒和上步中的重组子来转化根瘤土壤农杆菌。3.在菌体内因为

5、重组子中的T-DNA和野生型Ti质粒中的T-DNA有同源性会发生同源重组、等为交换，从而使野生型Ti质粒携带了外源性基因。4.含有外源性基因的野生型Ti，可随根瘤土壤农杆菌感染植物而进入到细胞内，同时可随T-DNA一起整合到植物宿主细胞的染色体中。5.在冠瘿氨基酸合成酶基因启动子作用下，进行高效率表达，同时T-DNA中抑制植物分化的作用被外源性基因的插入而削弱，从而使植物正常分化。目的基因与载体的连接黏性末端和平末端：a：沿着中轴线切口（即沿着DNA双链中对应的磷酸二酯键）切开，得到的就是两个平末端。b：在中轴线的两端切口切开，得到的就是两个黏性末端。例如:EcoRI限制性内

6、切酶就可以识别G/AATTC的DNA序列，然后在G和A间切开，得到的就是两个黏性末端。（之间可以根据碱基互补配对原则重组）限制酶的切口不都是一长一短的,一长一短的叫黏性末端,一样长的叫平末端。黏性末端和平末端：黏性末端的连接：单酶切黏性末端的连接双酶切黏性末端的连接平末端的连接（转化成黏性末端）由于连接平末端DNA片段时，所需底物浓度高，且连接效率低。所以一般需要进行修饰或改造形成黏性末端后再进行连接。图为人工接头连接法利用适配子来重组DNA分子连接产物导入受体细胞（细菌）氯化钙法将其导入受体细胞：利用氯化钙和热休克使受体菌成为感受态细胞，促进外源DNA进入。感受态细胞：宿主

7、细胞与重组DNA在0摄氏度的氯化钙溶液中孵育，快速转入42摄氏度造成热休克。经此处理后的细胞“容易”接受外源基因，一般叫做感受态细胞。处于感受态的细菌表面正电荷增加，细胞膜的结构有改变，通透性增强，转化子易于进入细胞。连接产物导入受体细胞（真核细胞）借助于载体的基因转移：主要是以重组的动植物病毒、反转录病毒及侵染植物的农杆菌Ti质粒直接传染受体细胞，把外源基因引入。不需借助载体的基因转移：1.磷酸钙沉淀法2.脂质体介导法3.血影细胞介导法4.电穿孔转移法磷酸钙沉淀法的原理：将转移基因的DNA溶液与适量的