《基因克隆》PPT课件

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1、基因工程及体外表达体系（1）.酶心血管病研究所王佐基因工程及体外表达体系酶载体方法第一节概述定义基本步骤意义定义：应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子（复制子、重组体），继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子拷贝，或其表达产物。RecombinantDNAtechnologyGenecloningMolecularcloningGeneengineeringGeneticengineering二、基本步骤目的基因的获得；目的基因与载体的连接；重组

2、DNA分子导入受体细胞；筛选出含重组DNA分子的受体细胞克隆；克隆基因的表达及表达产物的检测和分离纯化。三、意义重组DNA技术填平了生物种属间不可逾越的鸿沟；重组DNA技术缩短了进化时间；重组DNA技术使人能对生物进行定向改造。基因工程大事记1973Cohen第一例成功的克隆实验1978Genentech公司人胰岛素世界上第一种基因工程蛋白药物1982第一个基因工程药物--重组人胰岛素在英、美获准使用1985第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国转基因鱼1993基因工程西红柿在美国上市1997英国罗斯林研究所多莉羊1999.9中国获准加入人类基因组计

3、划.负责测定人类基因组全部序列的1%2000.6.26科学家公布人类基因组工作草图2001.2.11公布人类基因组基本信息生物技术工程：基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程、干细胞StanleyN.CohenHerbertBoyer“工程鲫”、“工程鲤”多利和它的孩子沃尔小组成功克隆两只恒河猴吴明杰小组：5只克隆猪第二节重要的工具酶限制性核酸内切酶；DNA聚合酶；DNA连接酶；T4多核苷酸激酶；碱性磷酸酶。一、RestrictionEndonucleases1定义限制性核酸内切酶（限制酶），是一类能识别和切割双链DNA分子内特定碱基顺序的核酸水解

4、酶。RestrictionEndonucleasesMadebybacteriaandviruses.Over500Restrictionendonucleasesexist.Thesewillcleaveover80specificsequences.2分类限制酶可分为3型。I型和Ⅲ型限制酶同时具有限制与修饰两种功能;I型限制酶没有固定的切割位点，随机切割产生非专一切口；Ⅲ型限制酶在DNA链上有特异切割位点，但其切割位点在识别位点以外。I型和Ⅲ型限制酶在分子克隆中用途不大。通常所指的限制酶是Ⅱ型酶。Ⅱ型酶对DNA水解有很强的特异性，它要求严格的顺

5、序作为切割点。切点顺序中有一个碱基的变异、缺失或修饰，便不再被水解，因此在分子克隆中常用，它被誉为分子生物学家的手术刀。Ex.EcoRⅠGAATTCCTTAAGAgaroseGelElectrophoresis3命名原则H．O．Smith和D．Nathams(1973)提议的命名系统已被公众所接受，其命名原则如下：从大肠杆菌（E.coli）R菌株分离到的几种限制酶，分别表示为EcoRⅠ、EcoRⅡ、EcoRⅤ等。限制酶第一个字母(大写，斜体)代表该酶的微生物(寄主菌)属名；第2、3个字母(小写，斜体)代表微生物种名。接下来的字母代表寄主菌的株或

6、型。如果从一种菌株中发现了几种限制酶，则根据发现和分离的顺序用罗马字母表示。RestrictionEndonucleaseEnzymes4Ⅱ型酶作用特点Ⅱ型酶有严格的识别、切割顺序，以内切方式水解双链DNA中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5’端为P，3’端为OH。识别顺序一般为4—6个碱基，通常是反转重复顺序，具有180°的旋转对称性,也称回文结构，palindrome,具有对称结构的DNA片段。一条链上的碱基顺序（例如从5‘3’）和另一条链上从5‘3’的顺序完全相同。例如，5‘GAATTC3’3’CTTAAC5’RErecognition/

7、cleavagesitearepalindromicDNAsequences,notpalidromicasin“ABBA”.E.x.EcoRⅠ5’GAATTC3’3’CTTAAG5'ThesesitesareDNAsequencethatareidenticalonbothDNAstrands.Q:Whichofthefollowing2DNAsequencesisapotentionalRErecognitionsite?Ⅰ.5’AGTTGA3’Ⅱ.5’GCACGTGC3’Q:Ifshowbelowis½ofaREsite,what

8、istheDNAsequencefortheremaining½?5’TCA___3’从理论上讲，如果DNA链上的A、