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1、流式配色分析及实验设计pefitc荧光素是具有荧光特性的染料只在特定波长激光照射后才发出自身荧光发出的荧光颜色（波长）也是固定的什么是荧光素关于流式抗体流式细胞技术：在细胞分子水平上；通过单克隆抗体；对单个细胞或其他生物粒子；进行多参数；快速的；定量分析。光学系统：经荧光染色的细胞在激光的照射下产生散射光和荧光信号，同时被前向光电二极管和一组光电倍增管（PMT）接收，荧光信号经一系列双色性反射镜和带通或长通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号光源液流通路信号和数据光源液流通路液流系统：鞘液包绕着单行排列的细胞
2、依次高速通过流动池，而激光聚焦于流动池中心的样本流上，随后经检测的样本和鞘液流向废液桶。前向角散射光信号侧向角散射光信号外周全血细胞散射光双参数点图 （红细胞溶解后）荧光信号使用不同荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量光学系统：滤光片如何将一束混合的荧光区分开来，分别进行收集呢？滤光片置于荧光探测器前，限定其接收的荧光的波长范围Longpass(LP)Shortpass(SP)Bandpass(BP)460500540460500540460500540SP500LP500
3、BP500/50流式结果除了染色的每个荧光抗体的表达情况，还包含了细胞的大小和复杂程度的情况FSC：前向角散射光，值越大，细胞越大SSC：侧向角散射光，值越大，细胞越复杂双参数散点图单参数直方图多色组合原则强弱搭配避免补偿减少偶联染料避开自发荧光流式细胞术中常见的荧光抗体一览荧光素激发波长发射波长发射光颜色BV421(V450)405450蓝BV510(V500)500绿BV605605红Fitc(AF488,BB515)488(561）530绿Pe(PI)578橙Percpcy5.5695红Pe-cy7780远
4、红Apc(AF647,ef660)635(640)660红Apc-cy7(Apc-H7,ef780)780远红荧光素颜色calibur/C6Verse，CantoII，AriaFortesa，新CantoFC500CytoflexBV421(V450)蓝可选可选可选BV510(V500)绿可选可选可选BV605红可选可选Fitc(AF488,BB515)绿11111Pe(PI)橙22222Percpcy5.5红33333Pe-cy7远红444可选Apc(AF647,ef660)红45534Apc-cy7(Apc-
5、H7,ef780)远红664可选常见流式仪可用荧光抗体一览荧光素颜色Verse，CantoII，AriaBV421(V450)蓝7BV510(V500)绿8BV605红Fitc(AF488,BB515)绿1Pe(PI)橙2Percpcy5.5红3Pe-cy7远红4Apc(AF647,ef660)红5Apc-cy7(Apc-H7,ef780)远红6可以也仅可以最多选择8个荧光抗体去标记抗原；需要注意：同一通道不可以选2种荧光抗体，例如：AF488，BB515,FITC不可以同时使用；CD5CD8染料的亮度与抗原表达
6、强度相匹配三大类:Primary:很好鉴定，容易区分阴阳性细胞群，阴阳性峰分得很开Examples:CD3,CD4,CD45Secondary:很好鉴定，较高水平表达，经常连续性表达Examples:CD27,CD28,CD45RA,CD45ROTertiary:低水平表达，激活性marker，或者表达区分不明显Example:CD25CD4CD45RACD25染料的亮度与抗原表达强度相匹配染料的亮度与抗原表达强度相匹配强弱搭配：即弱表达的抗原搭配强荧光，强表达的抗原搭配弱荧光荧光素的强弱：强4：APC,PE,P
7、E-CY7BV421弱4：Fitcpercpcy5.5apc-cy7BV510抗原的强弱：强的：CD3,CD4,CD8,CD45等弱的：大部分胞内/核内因子（IL系列，Foxp3等）；CD25,大部分CD大于100（CD127,CD133等）；染料的亮度与抗原表达强度相匹配染料的亮度与抗原表达强度相匹配Panel1染料的亮度与抗原表达强度相匹配Panel2染料的亮度与抗原表达强度相匹配Panel1染料的亮度与抗原表达强度相匹配Panel2避免补偿CD45-FITCDimCD4-PECD45FITC漏到PE，CD4
8、PE弱信号分不开CD45-PerCPDimCD4-PECD45PerCP不漏到PE，弱CD4可以分开UncompensatedCompensateddataspreadduetospillover避免补偿1）采用多激光激发减少重叠2）避免双激发荧光染料488激发：fitcpepercpcy5.5pe-cy7635激发：apcapc-cy7405激发：BV421BV510C
