《流式细胞凋亡分析》PPT课件

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1、流式细胞凋亡分析概念细胞凋亡（apoptosis）是指有核细胞在一定条件下通过启动其内部自身机制，主要是通过内源性DNA内切酶的激活而发生的细胞死亡过程。细胞凋亡是受基因控制的一种主动性细胞自杀过程，是生物体中一种普遍存在的现象。概念细胞凋亡是维持人体正常生理过程和功能活动所必需的，是多细胞生物生命活动过程中不可缺少的组成内容，是其藉以存活的需要，贯穿了生物全部生命周期中。概念细胞凋亡与细胞坏死（necrosis）是细胞死亡的两种模式，但两者有明显的区别。后者是由于细胞受到严重损伤或或大剂量细胞毒药物作用后发生的被动分解过程，并可导致周围组织的炎症反应。概

2、念细胞凋亡的作用主要包括以下几方面：清除无功能的细胞；控制细胞数量；清除病态的或有害的细胞；清除多余的细胞；细胞凋亡的特征形态学特征：光镜下，凋亡细胞最突出的形态学特征是细胞核固缩、染色质浓集、细胞变圆皱缩而细胞膜保持完整，其中胞核变化尤为突出。染色质的浓集可能是由于凋亡细胞核双链DNA发生裂解所致。细胞凋亡的特征形态学特征：DNA降解后，形成长度主要为180-200bp的DNA片断，随后细胞裂解成许多有膜包被的小体，称为凋亡小体（apoptoticbodies),最后被巨噬细胞吞噬，但不会引起周围组织的炎症反应。凋亡小体是凋亡细胞特征性的标志。如在显微镜

3、下观察到凋亡小体，则可确认为细胞发生了凋亡。细胞凋亡的特征形态学特征：电镜下，细胞核内可见高电子密度区，这是核DNA在核小体连接处断裂成核小体后，在异染色质区聚集形成的染色质浓缩块。染色质聚集区以外的低电子密度区为透明区，是由于核孔变大导致其通透性增加，细胞质中水分不断渗入而造成。线粒体增殖，呈空泡化。内质网腔扩大，为凋亡细胞形成自噬体提供包裹膜。细胞骨架变得致密、紊乱。细胞凋亡的特征形态学特征：细胞凋亡的特征形态学特征：细胞凋亡的特征形态学特征：共聚焦显微镜观察，凋亡细胞膜电位和线粒体膜电位下降，膜流动性降低。细胞膜上新出现了一些生物大分子如磷脂酰丝氨酸

4、（phosphatidylserine,ps)和凝血酶敏感蛋白等，这些分子的出现与凋亡细胞的清除有关。细胞凋亡的特征形态学特征：凋亡细胞另一个形态特征通过总DNA提取，DNA凝胶电泳分析，可呈现出梯状图谱，可见清晰的DNA〝梯子〞(ladder)。细胞凋亡的特征生化特征：1caspase蛋白酶：细胞凋亡的发生和发展过程也可能是水解酶级联切割的过程，它将大分子结构的物质如DNA、细胞骨架水解变性成小分子碎片，致使细胞发生凋亡。细胞凋亡的特征生化特征：1caspase蛋白酶：其中，半胱氨酸蛋白酶家族发挥了重要作用。它具有一段携带活化位点的保守氨基酸序列，可以特

5、异性识别、切割天冬氨酸转氨甲酰酶残基。由于这些蛋白酶具有相同的结构和功能特性而被称为caspase。细胞凋亡的特征生化特征：1caspase蛋白酶：caspase可能在凋亡细胞的形态变化中起了主导作用。Caspase通常是以酶原形式存在，通过其自身诱发的蛋白水解而转化为有活性的酶，活化的caspase进一步激活其他的caspase前体，形成了级联放大切割过程，裂解重要的大分子物质，导致凋亡。细胞凋亡的特征生化特征：1caspase蛋白酶：目前已发现15个caspase家族成员，分别命名为caspase-1～15，并根据其功能特点分成两类，即启动caspas

6、e(caspase-2、8、9、10）和效应caspase(caspase3、6、7）。细胞凋亡的特征生化特征：1caspase蛋白酶：启动caspase作用于凋亡信号触发后上游的不可逆位点。效应caspase由启动胱冬肽酶激活，作用于下游的执行位点，裂解细胞成凋亡小体。分子结构相互联系的这两部分影响线粒体，通过线粒体方式执行凋亡的信号。bcl-2家族成员能调节执行位点的进程。细胞凋亡的特征生化特征：1caspase蛋白酶：caspase-3是最重要的指示蛋白酶，为17kD和12kD亚单位组成的异二聚体。活化的caspase-3可以蛋白水解切割和激活其他c

7、aspase、相关的胞质靶位点（细胞因子18，CK18)和细胞核靶位点。Caspase-3切割CK18是凋亡过程中caspase切割发生的早期指示因子。细胞凋亡的特征生化特征：2核酸内切酶的激活：细胞凋亡时，内源性核酸内切酶被激活，将核小体间连接DNA降解，形成长度主要为180-200bp整数倍的寡核苷酸片段，组蛋白和其他核内蛋白质不降解，核基质也不改变。在DNA凝胶电泳分析中呈现出特征性“梯状”条带，而细胞坏死时，DNA片断大小不一，无“梯状”条带出现。但并非所有凋亡细胞都能检测到这种典型的生化特征。细胞凋亡的特征生化特征：2核酸内切酶的激活：细胞凋亡的

8、特征生化特征：3线粒体的变化：线粒体发生的重要改变之一就是凋亡诱导